Summary
プラスチック製のセクションでは、組織の多くの種類のパラフィン包埋や凍結切片より、この方法は、より有用に、蛍光二次抗体で免疫染色することができる組織の薄切片における真の組織形態を維持する。染色、プラスチック製の埋め込み、およびセクショニングするための方法はこのビデオで示されている。
Protocol
固定
- MEMFAまたは小さなガラスシンチレーションバイアルの3.7％FA + PBS（フィッシャー猫＃03 - 339 - 25B）に全胚または切除した外植片を移す。それ以上だけでなく、2時間、室温でnutatorにバイアルをインキュベートする、と。 2時間以上のためのFAに胚を放置しないでください。 FAでより長いインキュベーションは、胚組織が難しくなると検出プロセス中の抗体の貧しい浸透になります。
- FAの大部分を吸引し、バイアル（〜4.5ミリリットル）の上部に凹みの固定液を加える。ゆっくりと新鮮なデントの別の4.5ミリリットルで、デントのに交換して胚を洗浄するために数回用バイアルを逆さにし、 少なくとも48時間、-20 º Cで反応させる。一晩だけでは十分ではない。このステップでは、抗体のための胚はより透過になります。胚は数週間この状態で保持することができます。
免疫蛍光
- 試料を再水和。次のように、メタノールの段階的なシリーズで、それをインキュベートする。
75パーセントのMeOH / H 2 O 10分 50パーセントメタノール/ PBS 10分 25パーセントメタノール/ PBS 10分 PBS 10分 PBS 10分 - 60ミリメートルのプラスチック皿で1.5％アガロース/ PBSプレートを行います。それが固体になった後、アガロースの上にPBSを注ぐ。
- 胚の半セクショニング ：1.5％アガロース/ PBSプレートに胚を入れてください。ピンセットを持つ胚を取得し、薄いカミソリの刃を使用して、胚の中心を通って半分に切る。が正常にまっすぐな切断面を半分にカットしたものを選択してください。
- PBTとガラスシンチレーションバイアルに等分胚を移す。 20％ヤギ血清+ PBTの4.5ミリリットルと交換。 nutator（ブロッキング）に2時間室温でインキュベートする。
- PBTで一次抗体の適切な希釈を準備します。このあたりのサンプルの0.5ミリリットルが必要です。例えば、私は、5mmプラスチックのセクションでC -カドヘリンの細胞内局在を研究するために、ウサギ抗- C -カドヘリンPABの1 / 200希釈して使用。
- ブロッキング溶液を吸引し、希釈した一次抗体の0.5ミリリットルを追加します。発泡スチロールのチューブホルダーのスタンドアップポジションにバイアルを入れて。 nutator上で4℃で一晩インキュベートする。
- 希釈した一次抗体を（この希釈した一次抗体を保存して次の1〜2週間で再利用することができます）を取り外します。室温で4倍（40〜60分ごと）にPBTの4.5ミリリットルで洗う。
- PBTのビオチン標識二次抗体の1 / 100希釈の0.5ミリリットルと交換。 nutator上で4℃で一晩インキュベートする。光からビオチンを保護するためにアルミホイルでバイアルをカバーしています。
- この点から、 ケアは光、すなわち、からサ ンプルを保護するいくつかのカバーやアルミ箔の下にバイアルをなるように注意する必要があります。
- ビオチン-二次抗体（これはまた次の1〜2週間で再利用することができます）を取り外します。室温で4倍（40〜60分ごと）のために洗うか、PBTの4.5ミリリットル。
- PBTのストレプトアビジン（FITC、テキサス州 - 赤、等）蛍光標識の1 / 200希釈の0.5ミリリットルと交換。 nutator上で4℃で一晩インキュベートする。
- ストレプトアビジンを（これはあまりにも、再利用できる）を取り外します。室温 - 3回（30分ごとに15）にPBTの4.5ミリリットルで洗う。
- 室温で30分間、FA + PBS 3.7％4.5ミリリットルで胚を修正。
- PBSで2回の4.5ミリリットルで洗浄する。
- 試料を脱水する。次のように、エタノールの段階的なシリーズで、それをインキュベートする。
30パーセントエタノール/ H 2 O 10分 50パーセントエタノール/ H 2 O 10分 75パーセントエタノール/ H 2 O 10分 100パーセントエタノール 10分 - 試料は、光から保護するためにカバーを4 º Cで100％EtOHに格納することができます。
浸潤
- Technovit 7100浸潤のミックスを行います。私は通常、50ミリリットルコニカルチューブのベースの液体の15ミリリットル取る私を硬化剤の150mg追加し、15分間nutatorに揺れによってそれを混ぜる。この浸透のミックスは、最大1ヶ月のために4℃に保つことができる。
- 次のように、Technovit浸透ミックス/エタノールのコンボの段階的な一連と交換することにより、浸潤ミックスの試料を浸潤する。
- 50パーセントTechnovit /エタノール - 1時間
- 100％Technovit - 1時間
- 100％Technovit - 一晩
- 50パーセントTechnovit /エタノール - 1時間
- specimenは最大で4℃で一ヶ月100％の浸透ミックスに保存することができます光から保護するためのサンプルにカバーを置く。
埋め込み
- Technovit 7100埋め込みミックスを加えます。1.5mlチューブに浸透ミックスの0.75ミリリットルを取り、硬化剤II 50mlのを追加します。チューブを転倒数回で、それを混ぜる。
- プラスチック製のトランスファーピペットを用いて、0.5ミリリットル薄壁PCRチューブに入れ一晩浸透さ1検体を取る。上清のほとんどを削除します。
- 試料に、"埋め込み"、このセクションのステップ＃1で行われた埋め込みミックスの0.25ミリリットルを追加。オリエント優しく鈍い先端の解剖針（木製-扱う解剖針）でナッジが、チューブの底に直面している解剖の平面を作るために二等分胚。
- キャップを閉じて、プラスチックの重合可能にするために約4時間暗い場所にチューブをインキュベートする。
- Technovit 3040ミックスを加えます。ひょう量皿に粉の1グラムを取り、液体の0.5ミリリットルを追加します。すぐに、bluetipを使用して粉末と液体を混ぜる。硬化spacimenの上に注ぐ。この黄色のTechnovit 3040チューブから出てくるから、全体のプラスチック製のブロックを防止します。
セクショニング
- キシレンでHistoknife Hを拭きます（エタノールはしばしば十分ではない）し、ミクロトームでそれを設定します。約45 °で刃を傾けます。このエリアの清浄度が区分されたスライスの品質に重要なので、あまりにも、キシレンでブレードの前の段階のエリアを拭いてください。
- チューブの側面をカットし、段ボールナイフを使用してオフ先端剥離。
- ミクロトームのチャックホルダーに試料を設定します。
- 断面スライスの取付チャンバーを作るために、スライドガラス上に"、ボタンを押してシール"シリコンの絶縁体を取り付けます。しっかりとクリーンベンチトップでのスライドに絶縁体を押すと、絶縁体は完全に任意の気泡なしで接続されていることを確認するために他の側から見て。形状の凹面または凸面は起動されていない、それが水の表面が平らになることを見ることができるレベルにパスツールピペットを用いてスライド、、上のプールにクリーンで暖かいのdH 2 Oを（〜40 ° C）注ぐ。
- 断面スライスを作り始める。免疫蛍光研究のために、私は、5 mmの断面スライスを作る。目的や信号の強度に応じて、8ミリメートル- in situハイブリダイゼーションの試料では、スライスの厚さは〜3の範囲で調整することができます。
- 小さな絵筆を使用して、ブレードの正面のステージから水を取り付けチャンバーに断面スライスを運ぶ。水のプールの上にスライスと絵筆を持ち、鈍い先端の解剖針でそれをノックすることにより、水にスライスをドロップダウン。それは水の表面に当たるとスライスは、すぐに円形に展開されます。
- ほとんどの取付チャンバーの水の表面積のは、セクションのスライスで満たされている場合、パスツールピペットを用いて水のほぼ半分を吸い上げる。サンプルが完全に乾燥させるスライド暖かい一晩でスライドをインキュベートする。
- 5分間DAPI（TEで0.1mg/ml）1mlのあるカウンター染色。 DAPIを吸引し、サンプルを乾燥させる。
- スライドからシリコーンゴム絶縁体を取り除きます。今の写真はサンプルから撮影することができます。 4でサンプルを保存する·ライトから保護されてCを、。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | Buffer | 1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na2HPO4·7H2O 0.2 g KH2PO4The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave. | ||
| PBT | Buffer | Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC. | ||
| ·Dent’s fixative | Reagent | Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C. | ||
| 3.7% FA+PBS | Reagent | Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over. | ||
| Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat | Ab | Vector Laboratories | BA-9200 | |
| Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat | Ab | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT | Ab | Invitrogen | ALI3409 | BioSource™ |
| IgG (g), Goat Anti-Mouse | Ab | Invitrogen | M30115 | CALTAG™ |
| Fluorescent streptavidin kit | Reagent | Vector Laboratories | SA-1200 | Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure. |
| 20% goat serum/PBT | Buffer | This will be used as a blocking solution. | ||
| Small paintbrush | Tool | |||
| Dull-tip dissection needle | Tool | |||
| Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040 | Reagent | 7100 GMA , 3040 | glycol methacrylate | |
| Kulzer Tungsten Histoknife H | Tool | Energy Beam Sciences | H1310 | |
| 75% MeOH/H2O | Buffer | |||
| 50% MeOH/PBS | Buffer | |||
| 25% MeOH/PBS | Buffer | |||
| 30% EtOH/H22O | Buffer | |||
| 50% EtOH/H2O | Buffer | |||
| 75% EtOH/H2O | Buffer | |||
| 100% EtOH | Buffer | |||
| Small glass scintillation vials | Tool | Fisher Scientific | 03-339-25B | |
| 0.5 mL Thin-wall PCR tubes | Tool | Molecular BioProducts | 3430 | |
| Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators | Tool | Grace Bio-Lab Inc. | JTR1L-2.5 | 32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D |
| Thin razor blade | Tool | |||
| 1.5% Agarose in PBS | ||||
| Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies. | ||||
