Biology

Пластиковые вложения и секционирования Xenopus laevis Эмбрионы

Published: April 29, 2007 doi: 10.3791/188

Souichi Ogata¹, Shimako Kawauchi¹, Anne Calof², Ken W.Y. Cho¹

¹Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine (UCI), ²University of California, Irvine (UCI)

Summary

Пластиковые разделы сохранить истинный морфологии ткани в тонких срезов тканей, которые могут быть immunostained с люминесцентными вторичными антителами, что делает этот метод более полезным, чем парафин или замороженных срезов для многих типов тканей. Метод окрашивания, пластик вложение и секционирования показано в этом видео.

Protocol

Фиксация

Передача целых зародышей или расчлененный эксплантов в MEMFA или 3,7% FA + PBS в небольшой пузырек сцинтилляционных стекла (Fisher кошка # 03-339-25B). Инкубируйте флакон на nutator при комнатной температуре, только в течение 2 часов, и не более того. Не оставляйте эмбриона в Англии более чем на 2 часа. Более инкубации в ФА сделает эмбриональной ткани труднее и в результате плохого проникновения антител в процессе обнаружения.
Аспирируйте большинство из Англии и добавить фиксатором Дента до верхней части флакона (~ 4,5 мл). Аккуратно переверните флакон на несколько раз мыть эмбрионов в Дента, обмен с другим 4,5 мл свежего Дента, и инкубировать их в -20 º C в течение по крайней мере 48 часов. Ночь недостаточно. Этот шаг делает эмбрионов более проницаемой для антител. Эмбрионы могут храниться в таком состоянии в течение нескольких недель.

Иммунофлюоресценция

Увлажняет образца. Выдержите его в серии градуированных метанола, а именно:

75% MeOH / H ₂ O 10мин
50% метанола / PBS 10мин
25% метанола / PBS 10мин
PBS 10мин
PBS 10мин
Сделать 1,5% агарозном / PBS 60 мм пластин с пластиковой посуды. Налейте PBS на вершине агарозном после того, как становятся твердыми.
Hemi-секционирования эмбрионов: Положите эмбрионов в 1,5% агарозном / PBS пластины. Захватите эмбриона с парой щипцов и разрезать его пополам через центр эмбриона использованием тонким лезвием бритвы. Выберите те, которые вы успешно разрезать пополам с прямой плоскостью резания.
Передача пополам эмбрионов в стеклянный пузырек сцинтилляционных PBT. Обмен с 4,5 мл 20% козьего сыворотки + ПБТ. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов на nutator (блокировка).
Подготовка соответствующего разведения первичных антител в PBT. 0,5 мл этого в образцах не требуется. Например, я использовал 1 / 200 разведения кроликов анти-C-кадгерина паб для изучения субклеточных локализации С-кадгерина в 5 мм, пластиковые секции.
Аспирируйте блокирующий раствор и добавляют 0,5 мл разбавленного первичного антитела. Положите флаконов в стоячий положение на держателе трубки пенополистирола. Инкубируйте течение ночи при 4 ° С на nutator.
Удалить разбавленный первичного антитела (это разбавленный первичного антитела могут быть сохранены и повторно использованы в ближайшие 1-2 недели). Промыть 4,5 мл из PBT в 4 раза (40-60 минут) при комнатной температуре.
Обмен с 0,5 мл 1 / 100 разбавление биотин-сопряженных вторичными антителами в PBT. Инкубируйте течение ночи при 4 ° С на nutator. Обложка флаконах с алюминиевой фольгой для защиты от света биотин.
С этой точки зрения следует соблюдать осторожность для защиты образца от света, т. е. держать флаконах при некоторых крышкой или алюминиевой фольгой.
Удалить биотин-вторичные антитела (это может быть также использован в ближайшие 1-2 недели). Промыть или 4,5 мл из PBT в 4 раза (40-60 минут) при комнатной температуре.
Обмен с 0,5 мл 1 / 200 разбавление флуоресцентно меченных (FITC, штат Техас, красный и т.д.) стрептавидином в PBT. Инкубируйте течение ночи при 4 ° С на nutator.
Удалить стрептавидином (это может быть повторно использованы, тоже). Промыть 4,5 мл из PBT 3 раза (15 - 30 минут) при комнатной температуре.
Fix эмбрионов в 4,5 мл 3,7% FA + PBS в течение 30 минут при комнатной температуре.
Промыть 4,5 мл ФСБ в два раза.
Дегидрировать образца. Выдержите его в серии градуированных этанола, а именно:

30% этанола / H ₂ O 10 мин
50% этанола / H ₂ O 10 мин
75% этанола / H ₂ O 10 мин
100% этанола 10 мин
Образца могут быть сохранены в 100% этанола при 4 ° С с крышкой для защиты от света.

Инфильтрация

Сделать Technovit 7100 инфильтрации смеси. Я обычно берут 15 мл жидкости в базу 50 мл коническую пробирку, добавляют 150 мг отвердителя я и смешайте его покачиваясь на nutator течение 15 минут. Это проникновение смесь можно хранить при температуре 4 ° С на срок до одного месяца.
Проникнуть образца с инфильтрацией смеси путем обмена с градуированной серии Technovit проникновения смеси / EtOH комбо, а именно:
1. 50% Technovit / EtOH - 1 час
2. 100% Technovit - 1 час
3. 100% Technovit - ночь
Specimeя может быть сохранен в 100% проникновения смеси на срок до одного месяца при 4 ° C. Положите крышку на образцы, чтобы защитить их от света.

Вложения

Сделать Technovit 7100 вложение смесь: возьмите 0.75ml от проникновения смеси в 1,5 мл трубки и добавить 50 мл отвердителя II. Смешайте это путем обращения трубки в несколько раз.
Использование пластиковой пипетки передачу, взять один экземпляр проникли ночью в 0,5 мл тонкие стенки трубы ПЦР. Удалите большинство супернатант.
Добавить 0,25 мл вложения смесь, сделанную в шаге # 1 настоящего параграфа, "Погружение", к образцу. Восток пополам эмбриона, чтобы сделать вскрытие плоскости, стоящих перед нижней части трубки, осторожно подталкивать с тупым наконечником вскрытия иглой (деревянной ручкой рассечение иглы).
Закрыть крышкой и инкубировать трубка в темном месте в течение примерно четырех часов, чтобы позволить пластиковых полимеризации.
Сделать Technovit 3040 перемешать. Принимать по 1 грамм порошка для взвешивания блюдо, и добавьте 0,5 мл жидкости. Сразу же, смешать порошок и жидкость использованием bluetip. Залить сверху закаленной spacimen. Этот желтый Technovit 3040 позволит предотвратить весь пластиковый блок из выходящих из трубы.

Секционирование

Протрите Histoknife H с ксилолом (EtOH часто не достаточно хорошо) и установить его на свой микротоме. Угол лезвия примерно в 45 °. Протрите этапе площадь перед лезвие с ксилол, тоже, потому что чистота этой области имеет решающее значение для качества секционного ломтиками.
Вырезать стороне трубки и кожуры кончик использованием картона ножом.
Установить образец в держатель патрон микротоме.
Прикрепить "пресс-к-печать" кремний изолятор на предметное стекло, чтобы сделать монтаж камеры по разделу ломтиками. Плотно прижмите изолятор, чтобы скользить по чистой настольные и посмотреть с другой стороны, чтобы убедиться, что изолятор полностью прилагается без каких-либо воздушных пузырьков. Залить чистой и теплой дН ₂ O (~ 40 ° C) с бассейном на слайд с помощью пипетки Пастера до уровня, на котором видно, что поверхность воды становится плоским, а не вогнутые или выпуклые формы.
Начните делать разделе ломтиками. Для иммунофлюоресценции исследования, я делаю 5 ломтиков мм разделе. Ибо в месте образцы гибридизации, толщина ломтиков можно регулировать в диапазоне от ~ 3 - 8 мм, в зависимости от целей и интенсивности сигналов.
Carry разделе ломтиками со сцены перед лезвием к монтажной камере с водой, используя маленькую кисть. Держите кисть с кусочком поверх воды в бассейне и падение срез вниз к воде, сбивая его с тупым кончиком иглы рассечение. Часть будет расширяться в круглую форму, как только она попадает на поверхность воды.
Когда большинство площадь водной поверхности монтажа камера заполняется раздел ломтиков, поглощать почти половина из воды с помощью пипетки Пастера. Инкубировать слайд на слайде теплее ночь, чтобы сделать выборку полностью высохнет.
Counter-пятно с 1 мл DAPI (0.1mg/ml в ТЕ) в течение пяти минут. Аспирируйте DAPI и сухой образец.
Удалите изолятор силиконовой резины от слайд. Теперь фотографии можно взять пробы. Магазин образца при 4 ° С, защищенном от света месте.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Buffer			1 L recipe: 8.0 g NaCl 0.2 g KCl 2.68 g Na₂HPO₄·7H₂O 0.2 g KH₂PO₄The pH is supposed to be 7.4. Adjust the volume to 1 L. Autoclave.
PBT	Buffer			Add 0.5 mLl of Triton X-100 and 1.0 g of BSA (Molecular Biology grade, fraction V is good [>99%], but don’t use crude 97% Albumin) to 500ml of autoclaved PBS. Filtrate through 0.2 mm filter cup. Store it in 4ºC.
·Dent’s fixative	Reagent			Mix 40 mL of methanol and 10 mL of DMSO. Keep it in –20°C.
3.7% FA+PBS	Reagent			Mix 37% formaldehyde and PBS at 1:9 ratios. Make it fresh at each time and discard the left over.
Biotinylated Anti-Mouse IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-9200
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L), made in goat	Ab	Vector Laboratories	BA-1000
IG’S HUADS BIOTIN GTXRBT	Ab	Invitrogen	ALI3409	BioSource™
IgG (g), Goat Anti-Mouse	Ab	Invitrogen	M30115	CALTAG™
Fluorescent streptavidin kit	Reagent	Vector Laboratories	SA-1200	Contains streptavidin labeled with three different fluorophores (FITC, Texas Red and AMCA) suitable for this procedure.
20% goat serum/PBT	Buffer			This will be used as a blocking solution.
Small paintbrush	Tool
Dull-tip dissection needle	Tool
Kulzer Technovit 7100 GMA , 3040	Reagent		7100 GMA , 3040	glycol methacrylate
Kulzer Tungsten Histoknife H	Tool	Energy Beam Sciences	H1310
75% MeOH/H₂O	Buffer
50% MeOH/PBS	Buffer
25% MeOH/PBS	Buffer
30% EtOH/H₂2O	Buffer
50% EtOH/H₂O	Buffer
75% EtOH/H₂O	Buffer
100% EtOH	Buffer
Small glass scintillation vials	Tool	Fisher Scientific	03-339-25B
0.5 mL Thin-wall PCR tubes	Tool	Molecular BioProducts	3430
Press-to-Seal Silicone Rubber Insulators	Tool	Grace Bio-Lab Inc.	JTR1L-2.5	32 mm L x 19 mm W, 2.5 mm D
Thin razor blade	Tool
1.5% Agarose in PBS
Primary antibody against your antigen or epitope tags: Make an appropriate dilution in PBT.Biotin-conjugated secondary antibody: various vendors sell biotin-conjugated antibodies.