Summary
Microscopie multiphotonique permet de contrôler les photons de basse énergie avec une pénétration profonde et optiques phototoxicité réduite. Nous décrivons l'utilisation de cette technologie pour l'étiquetage de cellules vivantes dans des embryons de poissons zèbres. Ce protocole peut être facilement adapté à la photo-induction de diverses molécules lumière réactive.
Abstract
Photoactivation de composés cibles dans un organisme vivant a prouvé une approche intéressante pour étudier divers processus biologiques tels que le développement embryonnaire, la signalisation cellulaire et la physiologie adulte. À cet égard, l'utilisation de multi-microscopie biphotonique permet photoactivation quantitative d'un agent donné réactive la lumière dans les tissus profonds, à une résolution seule cellule. Comme embryons de poissons zèbres sont optiquement transparents, leur développement peut être contrôlé in vivo. Ces traits font le poisson zèbre, un organisme modèle parfait pour contrôler l'activité d'une variété d'agents chimiques et des protéines par la lumière concentrée. Nous décrivons ici l'utilisation de la microscopie à deux photons pour induire l'activation de la cage chimiquement la fluorescéine, qui à son tour nous permet de suivre le destin des cellules dans des embryons de poisson zèbre en direct. Nous utilisons des embryons exprimant un point de repère direct génétique (GFP) pour localiser et cibler précisément les cellules d'intérêt. Cette procédure peut être également utilisé pour l'activation induite précise la lumière des protéines, des hormones, des petites molécules et autres composés en cage.
Protocol
Nous décrivons un protocole de marquage cellulaire à l'aide de fluorescéine en cage, cependant, d'autres photo-activable colorants et les protéines peuvent être également utilisés.
1. L'injection de fluorescéine Caged
- Préparer une solution stock de 5% (5mg cage-fluorescéine / KCl 100 uL 0,2 M) de dextrane conjuguées 4,5-diméthoxy-2-nitrobenzyle (DMNB) en cage fluorescéine (10.000 MW dextrane, des polymères anioniques, Invitrogen, sondes moléculaires, Carlsbad, CA , cat. aucune. D-3310). Aliquoter et stocker dans -20 ° C. Notez que DMNB-cage fluorescéine est sensible à la lumière et doit être conservé dans l'obscurité.
- Préparer une cuvette d'injection faite de 1% d'agarose (Sigma, St. Louis, MO, cat. Aucune. A9539) comme décrit dans «Le livre de poisson zèbre» 1.
- Préparer deux litres de milieu de l'E3 en diluant une solution stock de 100 x E3.
- Le soir avant l'injection, préparer des cages d'accouplement qui sépare le mâle (s) de la femelle (s) de la ligne souhaitée transgéniques exprimant un point de repère visible fluorescente (GFP, RFP etc) utilisé pour localiser les cellules cibles pour la photoactivation.
- Préparer aiguilles d'injection capillaire (mince paroi de verre capillaires avec filament, Instruments de précision mondiale, Sarasota, Floride, cat. Aucune. TW100F-6) en utilisant un extracteur micropipette (Instrument Sutter, Novato, CA, P-97).
- Dégeler une aliquote de 5% en cage fluorescéine sur la glace.
- Diluer le solution à 5% en cage stock de fluorescéine dans KCl 0,2 M à une concentration finale de 1%, et de garder sur la glace. Éviter l'exposition lumineuse.
- L'accouplement de configuration traverse préparé à l'étape 4.
- Ramassez les œufs fécondés dès qu'ils sont pondus. Embryons d'Orient stade unicellulaire dans le moule d'injection d'agarose recouvertes de E3 1.
- En utilisant une pointe microloader (Eppendorf, Hambourg, Allemagne, cat. Aucune. 956,003 5242) remblayer une aiguille d'injection avec ~ 1 pl de 1% en cage solution de fluorescéine.
- Placez chargés aiguille dans un micromanipulateur attaché à une essence microinjecteur (pneumatique picopump, World Precision Instruments, Sarasota, Floride, PV820).
- Réglez le volume d'injection 2-3NL et injecter le cage-fluorescéine directement dans le cytoplasme de la cellule. Injecter un minimum de 50 embryons par expérience.
- Incuber embryons dans l'obscurité à 28,5 ° C à l'E3 à l'étape désirée du développement. Si les embryons âgés de plus de 24 heures après fécondation sont analysés, ajouter phénylthiourée 0,1% (PTU, Sigma, St. Louis, MO, cat. Aucune. 22290-9) pour inhiber la pigmentation.
2. Embryon de montage
- Préparer une nouvelle solution E2 (voir partie des solutions; peuvent être conservés à 4 ° C pendant une semaine).
- Manteau de 60 mm boîte de Pétri avec une couche mince de 1% d'agarose dissous dans le milieu de l'E2.
- Préparer 2% point de basse température de fusion d'agarose (ultra pur agarose LMP, Invitrogen, Carlsbad, CA, n ° 16520100..) Pour l'intégration: dissoudre l'agarose dans l'eau distillée stérile doubler d'ici à chauffage micro-ondes jusqu'à ébullition. Laisser le bouchon du tube ouvert pendant le chauffage. Aliquote de 1 mL dans des microtubes et conserver dans un bloc chauffant à 72 ° C.
- Retirez le chorions des embryons en tirant doucement sur le chorion dehors avec une pince forte (n ° 5). Gardez embryons dans une solution de E2 sur un plat d'agar-couché (voir étape 2). Embryons Dechorionated doivent être manipulés avec polie au feu pipette Pasteur en verre, car ils peuvent coller à Pipettes en polypropylène. Évitez d'exposer l'embryon dechorionized à l'air que ces embryons pourraient être endommagés par la tension de surface liquide.
- Recueillir l'embryon sélectionné dans un petit volume de E2 en utilisant une polie au feu pipette Pasteur en verre, et placer l'embryon sur 60 mm boîte de Petri. Monter une goutte (~ 150 pi) de 2% d'agarose (étape 3) à côté de l'embryon. Mélanger rapidement les deux gouttes d'obtenir un mélange homogène finale ~ 1% d'agarose et en utilisant un microscope à dissection d'orienter l'embryon avec sa face dorsale face à l'objectif.
- Attendez jusqu'à ce que l'agarose est solidifié et ajouter moyenne E2 jusqu'à l'embryon incorporé est immergée dans un liquide. Il est préférable d'obtenir un seul embryon par plat comme il peut être libéré de l'agarose après le processus de photoactivation.
3. Photoactivation
- Nous utilisons un Zeiss LSM 510 META RNL deux photons microscope équipé d'une large bande accordable (700-1020nm) Mai Tai-HP-laser femtoseconde à partir Spectraphysics.
- Placez l'embryon monté sur un support de plaque sous le microscope. Le point de repère fluorescente dans l'embryon est visualisée à l'aide d'eau immergée 40x/0.8W Achroplan objectif. Pour les étapes suivantes, nous utilisons non descanned détecteur (DDN) avec filtre passe-bande (BP) de 500-550nm.
- Comme condition préalable au processus de photoactivation, obtenir des informations spatiales fluorescent de la région d'intérêt par l'acquisition de séries d'images de la plus ventrale à la partie dorsale du signal détecté fluorescent avec deux photons de longueur d'onde laser de 860nm (pour la détection de la GFP). À cette fin, une résolution suffisante peut être obtenue en utilisant une période de 6 microns entre chaque plan focal acquises.
- Sélectionnez la ciblez-avion pour photoactivation et amener cette région dans le foyer. Selon le but de l'expérimentation, la région d'intérêt peut être soit au sein ou en dehors de la GFP repère visible. Prenez une image unique dans ce plan z. Enregistrer l'image et la garder ouverte dans une fenêtre séparée.
- Régler la longueur d'onde laser à deux photons à 720nm et lorsque le laser est en mode bloqué ouvrir le menu "Modifier l'eau de Javel». Définissez la région d'intérêt (ROI) pour photoactivation en fonction de l'image prise à 860nm (étape 4) en utilisant le menu "Définir la région». Il est crucial de choisir le retour sur investissement de cette image après décalage de la longueur d'onde laser à 720nm comme la dernière action change la positions X, Y du champ observé.
- Ajustez les paramètres suivants pour la photoactivation dans le menu «Modifier l'eau de Javel» (voir étape 9): un pouvoir) laser par rapport; b) le nombre d'itérations; c) la vitesse de balayage.
- "Bleach" de presse dans la fenêtre "Modifier l'eau de Javel» et attendre l'arrêt du laser.
- Revenez à 860nm, acquérir une image plane unique pour évaluer l'intensité de la matière résultant photoactivé et une deuxième série d'acquisition d'image pour évaluer le Z-span (épaisseur) du domaine activé.
- Considérez les paramètres suivants pour la photoactivation:
- On doit déterminer empiriquement les conditions optimales pour la photoactivation en faisant varier deux paramètres: l'intensité du laser et la durée de photoactivation. La puissance du laser relative peut être contrôlée par le modulateur acousto-optique (AOM) de transmission. La durée de la photoactivation est une fonction du nombre d'itérations et de la vitesse de balayage.
- Déterminer la gamme linéaire de l'intensité de fluorescence afin d'éviter la saturation de la fluorescence Uncaged.
- Il existe une corrélation linéaire entre l'intensité obtenue par fluorescence des molécules Uncaged et la durée de l'axe z du clone photoactivé 2.
4. Détection de la fluorescéine Uncaged
- Après photoactivation, élever les embryons dans l'obscurité à 28,5 ° C dans un milieu contenant 0,1% E2 PTU pour prévenir l'apparition de la pigmentation de la peau.
- Au stade de développement désiré, retirer l'embryon de l'agarose sous un microscope à dissection. Utiliser un objet pointu scalpel, de créer un "V" incision en forme de l'agarose à proximité de l'embryon afin que le "V" est dirigé vers la tête de l'embryon. Placez une pince fermée au point de le "V" près de la tête de l'embryon et poussez doucement la pince ouverte séparant l'agarose sur toute la longueur de l'embryon et de libérer l'embryon dans le milieu.
- Recueillir les embryons avec une pipette Pasteur polie au feu et de fixer avec du paraformaldéhyde (PFA; 4% en 1 x PBS, pH 7,2) soit pour 3 heures à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Retirer la solution de fixation et rincer 2-3 fois en PBST pendant au moins 5 minutes à température ambiante.
- Lavez embryons avec du méthanol à 100% pendant 10 min, de reconstituer avec du méthanol frais et incuber à -20 ° C pendant au moins 2 heures.
- Réhydrater embryons par des incubations successives (5 mn chacune) dans une série de méthanol dilué dans PBSTr: 80%, 60%, 40% et 20%. Lavez 2 x 10 minutes dans PBSTr.
- Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans 500 uL de solution de blocage.
- Ajouter une phosphatase anti-fluorescéine-alcaline (AP) des fragments Fab (Roche, Palo Alto, Californie, cat. Aucune. 11426338910), dilué à 1:500 dans une solution de blocage et incuber une nuit à 4 ° C (microtubes place sur les côtés) .
- Laver 5 x 15 minutes dans du PBST.
- Laver pendant 5 minutes dans 0,2 M de NaCl dans la TNT.
- Laver pendant 5 minutes dans 0,4 M de NaCl dans la TNT.
- Equilibrer 3 x 5 minutes dans une solution Prestain fraîchement préparés.
- Dissoudre un comprimé de Fast Red (Roche, Palo Alto, Californie, cat. Aucune. 11496549001) dans 2 ml Prestain solution. Il est recommandé de filtrer la solution en utilisant du papier Whatman n ° 2 à omettre non dissous particules. Alternativement, ralentit solution et utiliser le liquide clair surnageant.
- Ajouter 500 ul solution Fast Red à chaque tube, incuber dans l'obscurité à température ambiante, et le développement moniteur couleur désirée jusqu'à ce que le signal sur bruit est atteint (20 minutes à plusieurs heures). Si de fond se développe, le transfert à 4 ° C. Après une heure d'incubation, de reconstituer avec une solution nouvelle coloration Fast Red.
- Arrêter la réaction de coloration par 3 x 5 minutes lavages en PBST.
- Fix pendant 20 minutes dans 4% PFA à température ambiante.
- Lavez 2 x 5 minutes dans du PBST.
- Embryons clair à travers une série de 25%, 50% et 75% de glycérol dans du PBS jusqu'au embryons sont déposés au fond du tube. Les embryons peuvent être conservés à 4 ° C pendant quelques jours.
5. Visualisation fluorescent de l'Espace Uncaged
- Préparer une lame de microscope pour le montage: en utilisant une seringue de 1 mL appliquer quatre taches de graisse silicone transparent sur la diapositive, placé à une distance de ~ 15mm de l'autre. Mont de l'embryon au Center dans ~ 200 ul de glycérol 75% et placer une lamelle (n ° 0; 18x18mm) sur le dessus et doucement pousser contre le silicone jusqu'à ce que la solution de glycérol occupe la surface entre les diapositives.
- Placez l'embryon monté sur la scène et de le mettre en mise au point avec un objectif 40x. Acquérir une confocale Z-série d'images en utilisant 488nm Argon et 543nm lasers HeNe comme source d'excitation.
- La durée de l'axe z du domaine photoactivatated peuvent être analysés en utilisant la reconstruction 3D de l'embryon Uncaged aide d'un logiciel d'analyse d'image.
6. Solutions
| 100 x E3 | 174mm de NaCl, KCl 21mm, 12mm MgSO 4, 18mm Ca (NO3), 15mm HEPES, pH = 7,4. Stériliser par filtration et stocker à 4 ° C |
| 20 x E2 | 0,3 M de NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl 2 * 2HOH, 20mm MgSO 4 * 7HOH, 3mm KH 2 PO 4, 0,8 Na 2 HPO 4 * 2HOH, filtrat et stocker à la température ambiante |
| 1 x E2 | Diluer 20 x E2 dans l'eau bidistillée et ajouter fraîchement NaHCO 3 (à la concentration finale de 0,7 mm), pénicilline et streptomycine (solution diluée streptocoque stylo pour une concentration finale de 1 x qui contient 100U de pénicilline et la streptomycine 100mg par ml (Invitrogen , Carlsbad, CA, cat. aucune. 15140-122)) |
| PBST | 0,1% de Tween-20 dans du PBS |
| PBSTr | Triton de 0,3% en PBS |
| Solution de blocage | 10% de BSA, Triton 0,3%, 1% de DMSO dans du PBS |
| TNT | 100 mM Tris-HCl pH-7.5, 150 mM NaCl, 0,5% Tween-20 dans de l'eau bidistillée |
| Solution Prestain | 100 mM Tris-HCl pH-8.2, 0,4 M de NaCl, 0,1% Tween-20 dans de l'eau bidistillée |
7. Les résultats représentatifs
Un exemple de l'utilisation de la microscopie à deux photons pour photoactiver agents dans un embryon de poisson zèbre vivant est présenté. En utilisant une approche similaire que nous avons déjà tracé la lignée de la photoactivé étiquetés progéniteurs neuronaux dans le cerveau de poisson zèbre 2,3. La figure 1 montre photoactivation d'un colorant fluorescéine cage conjugués dans la plaque neurale antérieure de l'embryon de poisson zèbre portant un neurog1:: gfp journaliste transgène, qui a servi de point de repère direct intrinsèque.
Les embryons ont été injectés avec de la fluorescéine en cage au stade une cellule et embarqué dans l'agarose au stade du bouton. A 3 - 5-somite scène les coordonnées spatiales ont été mesurés dans le neurog1:: gfp transgéniques embryon afin de déterminer la région d'intérêt (ROI) pour uncaging (figure 1A, A '). Nous Uncaged le traceur lignée fluorescéine dans un domaine spécifique de la plaque neurale (figure 1B, B '). Par la suite, le sort de ce sous-domaine donné progénitrices neurales étiqueté a été déterminée à prim5 (24 heures après fécondation) étape par immunomarquage de l'Uncaged fluorescéine (figure 1C, C ').
L'étendue de deux photons laser uncaging, c'est à dire l'intensité de la fluorescence Uncaged et l'épaisseur du domaine photoactivé (z-span), peut être contrôlée en ajustant deux paramètres: l'intensité du laser et la durée. Ce dernier peut être contrôlé par un ajustement du nombre d'itération et la vitesse de balayage (voir partie 3, étape 9; Russek-Blum, 2009). Dans l'exemple montré dans la figure 1, nous avons utilisé la puissance du laser relative de transmission OMA 12%, 20 itérations et vitesse de balayage de 25,6 msec / pixel. En utilisant ces paramètres, nous étiquetés contenant un ROI de 90 à 10 cellules et un photoactivé z de vie de 30 um (~ 1-2 rangées de cellules).
Figure 1. Un résultat Représentant de photoactivation de fluorescéine en cage dans embryons de poissons zèbres en direct en utilisant microscopie à deux photons.
Illustration schématique (AC) et des images représentatives (A'-C ') du processus de photoactivation. En direct d'embryons de poisson zèbre (A, A ') exprimer la GFP sous le contrôle de Neurogenin-1 promoteur (neurog1:: GFP) qui a été injecté avec cage fluorescéine traceur au stade 1 cellule. Au 3-5 - stade de somites, une zone discrète de l'ébauche du prosencéphale (diencéphale) a été photoactivé et le Uncaged fluorescéine colorant traceur a pu être détecté (B, B '). Suite à la procédure de photoactivation, l'embryon a été incubé à 28,5 ° C et les cellules du cerveau contenant la fluorescéine ont été tracées par Uncaged anti-fluorescéine immunomarquage moins 24 heures après fécondation (HPF, C, C '). Dien, diencéphale;. Tel, télencéphale..
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Discussion
Photo-activable composés sont des molécules dont la fonction est masqué jusqu'à ce qu'ils soient éclairés par une longueur d'onde spécifique (généralement UV), induisant une réaction photochimique qui convertit les molécules dans un état biologiquement ou chimiquement active. Ces sondes fournissent des outils très puissants dans la recherche en biologie cellulaire, puisque l'activation peut être contrôlée avec précision temporellement et spatialement en limitant leur exposition à la lumière.
L'avantage significatif du multi-microscopie biphotonique est son taux de pénétration relativement profonde optiques et de réduire la phototoxicité non spécifiques. Pour le processus d'activation, deux photons de basse énergie doit être absorbée par le composé photo-activable dans le même temps. Comme la probabilité d'un tel événement est dépendante de la densité de photons, l'activation reste limitée au plan focal. La région d'activation peut donc être manipulé de manière sélective dans un volume défini dans le tissu.
Nous présentons un protocole pour la photoactivation de fluorescéine en cage à l'aide microscopie à deux photons dans des embryons de poissons zèbres vivent. Dans l'exemple précis montré ici que nous utilisons microscopie à deux photons pour induire en cage-fluorescéine photolyse afin de marquer les cellules à premiers stades embryonnaires et par la suite suivre la lignée des cellules marquées dans le cerveau de poisson zèbre en développement. En comparaison avec photoactivation par laser et flash-lampe, qui aboutit à l'activation du colorant dans les quelques dizaines de cellules et le manque de résolution dans l'axe z 4,5, à deux photons à base de photoactivation peut atteindre une résolution spatiale de quelques micromètres d'obtenir la résolution axiale de un à deux rangées de cellules proximale 2,3.
La procédure rapportés ici peuvent être utilisées pour l'activation d'une variété de composés à une résolution seule cellule de spécimens vivants. Par exemple, la protéine Kaede peut être pareillement utilisée pour marquer les cellules après sa photoconversion d'un vert au rouge fluorescenct protéines 6,7. Autres activé par la lumière des protéines qui peuvent être appliqués comprennent le canal ionique de lumière-dépendants, Channelrhodopsin, qui peuvent moduler l'activité neuronale 8 et photosensibilisateurs tels que KillerRed, qui induit la mort cellulaire lors d'une irradiation de lumière 9.
Une variété de molécules cages ont été signalés, en permettant la modulation des processus physiologiques par la manipulation de composés extracellulaires et intracellulaires 10. Il s'agit notamment, des neurotransmetteurs actifs (par exemple le glutamate 11,12) et les seconds messagers (par exemple le calcium 13) et les hormones stéroïdes (par exemple l'acide rétinoïque 14). Enfin, la photo-médiée contrôle de l'activation des gènes et de faire taire chez le poisson zèbre a été introduit. Photoactivation à deux photons à base d'oligonucléotides antisens cage (morpholinos) et ARN peut être utilisé pour abattre des gènes et de gain de fonction dans la population cellulaire restreinte d'un embryon de poisson zèbre vivons 15,16.
En somme, à deux photons à base de photo-activation dans embryons de poissons zèbres en direct est: 1) précise-un à deux rangées de cellules le long des axes z x, y,. 2)-dans la mesure quantitative de la photoactivation peut être contrôlé. 3) Polyvalent-peut être appliquée pour une variété de photo-convertibles protéines.
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Acknowledgments
Merci sont dus à Génia Brodsky pour la figure graphiques; Vyacheslav Kalchenko, Douglas Lutz, et Leonid Roitman pour des conseils et une assistance technique avec le uncaging deux photons; Maayan Tahor et Suliman Elsadin d'assistance technique; Uwe Strähle d'avoir bien voulu fournir la ligne de journaliste et de neurogenin1 Amos Gutnick pour les commentaires sur ce manuscrit. La recherche dans le laboratoire Levkowitz est soutenu par la Fondation allemande-israélien (le numéro de subvention 183/2007); Israel Science Foundation (numéro de subvention 928/08) et le Harriet & Marcel Dekker Fondation. GL est un titulaire de la Chaire Développement Tauro carrière en recherche biomédicale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-conjugated 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl (DMNB) caged fluorescein (10,000 MW dextran, anionic) | Invitrogen | D-3310 | molecular probes |
| Agarose for injection trough and coated plates | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-6 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments, Inc. | PV820 | |
| Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | 22290-9 | |
| Low melting point agarose for embryo mounting | Ultra Pure LMP agarose | 16520100 | |
| Anti-Fluorescein- alkaline phosphatase (AP) Fab fragments | Roche Group | 11426338910 | |
| Fast Red | Roche Group | 11496549001 |
References
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