Biology

Verwendung eines automatisierten Cell Counter zu Genexpressionsstudien Simplify: siRNA Knockdown von IL-4 abhängige Genexpression in Namalwalzellen

Published: April 14, 2010 doi: 10.3791/1904

Adam M. McCoy¹, Claudia Litterst¹, Michelle L. Collins¹, Luis A. Ugozzoli¹

¹Gene Expression Division, Bio-Rad Laboratories

Summary

Dieses Verfahren beschreibt eine schnelle und einfache Workflow siRNA in schwierigen einzuführen, um Zelllinien zu transfizieren und folgen Genexpression durch real-time PCR. Verwendung eines automatisierten Zellzahl, bieten Multi-Well-Platte Elektroporation und automatisierte Elektrophorese Station schnelle und zuverlässige Ergebnisse ohne die Notwendigkeit für teure Roboter-Handling.

Abstract

Die Verwendung von siRNA-vermittelten Gen-Knockdown ist weiterhin ein wichtiges Instrument in Studien der Genexpression werden. siRNA-Studien werden durchgeführt, nicht nur die Auswirkungen der Herunterregulieren einzelner Gene zu studieren, aber auch Signalwege und andere komplexe Interaktion Netzwerke zu verhören. Diese pathway-Analysen erfordern sowohl die Verwendung der entsprechenden zellulären Modellen und Methoden, die weniger Störung der zellulären Physiologie verursachen. Die Elektroporation wird zunehmend als ein wirksames Mittel zur siRNA und anderen Nukleinsäuren in schwierigen einzuführen, um Zelllinien und Primärzellen, ohne den Signalweg untersucht transfizieren verwendet. Es gibt mehrere wichtige Schritte zu einer erfolgreichen siRNA Experiment, und es gibt Wege, um die Arbeit zu vereinfachen und gleichzeitig die Verbesserung der Datenqualität in mehreren experimentellen Stadium. Um Ihnen bei Ihrem siRNA-vermittelten Gen-Knockdown Projekt gestartet haben, werden wir demonstrieren, wie man einen Weg Studie komplett aus Sammeln und Zählen der Zellen vor der Elektroporation durch post Transfektion real-time PCR Genexpressionsanalyse durchführen. Die folgende Studie untersucht die Rolle des Transkriptionsaktivators STAT6 in IL-4 abhängige Genexpression von CCL17 in einer Burkitt-Lymphom-Zelllinie (Namalwa). Die Techniken demonstriert werden für eine breite Palette von siRNA-Experimenten auf beiden adhärenten und Suspensionszellen nützlich. Wir werden auch zeigen, wie man Zellzählung mit dem TC10 automatisierte Zelle zu begegnen, wie man mehrere Proben gleichzeitig mit dem MXcell Elektroporationssystem elektroporieren, und wie man gleichzeitig zu beurteilen RNA Qualität und Quantität mit dem Experion automatisierte Elektrophorese-System zu optimieren.

Protocol

1. Die Vorbereitung und das Zählen der Namalwalzellen

Entfernen Zellen aus Kulturflasche und Zentrifuge die Zellen zu pelletieren. Überstand entfernen und die Zellen in einem bekannten Volumen von PBS. Die Zellen in diesem Protokoll verwendet werden Suspensionszellen. Wenn Sie mit adhärenten Zellen werden, müssen Sie vor dem Sammeln trypsinize.
Um zu bestimmen, die Anzahl der lebenden Zellen, Fleck ein Aliquot der Zellsuspension durch Mischen 1:1 mit einer 0,4% Trypanblau-Lösung angesetzt und 10 ul der Mischung auf eine Zählung Rutsche, und fügen Sie dann den Schieber in die TC10 automatisierte Zelle counter (Bio-Rad Laboratories, Inc).
Die TC10 Zelle Zähler Autofokus zu gewährleisten, die genaue Anzahl, und fahren Sie dann mit dem Zählen. Es ermittelt automatisch die Dichte von lebenden Zellen und insgesamt Zellen in der Probe.
Ansicht auswählen Bild, um die Zellen auf dem Hauptschirm angezeigt. Wählen Sie dann die Verdünnung Rechner, um die TC10 Zellzähler haben berechnet automatisch die Höhe der Zelle Mischung, die benötigt werden.
Dieses Experiment ist mit insgesamt drei siRNAs: eine Kontroll-siRNA und zwei verschiedenen siRNAs die STAT6 Gen, plus untransfizierte steuert. Dies erfordert 3,6 ml in einer Endkonzentration von 5 x 10 ⁶ Zellen pro ml.
Geben Sie die gewünschte Konzentration und letzte Band von Werten in der Verdünnung-Rechner, und berechnet das Volumen der Zellsuspension benötigt basierend auf den Live-Zellzahl für diese Probe. Alternativ führen Sie die Berechnung manuell. Übertragen Sie anschließend die gewünschte Lautstärke der Zelle Mischung für diese Experimente in ein neues Röhrchen.
Spin the Zellgemische die Zellen zu pelletieren und entfernen Sie alle PBS. Resuspendieren in 3,6 ml Gene Pulser Elektroporation Puffer (Bio-Rad Laboratories). Transfer-800 ul Aliquots in Röhrchen mit den entsprechenden siRNAs und vorsichtig mischen. Die Zellen sind nun bereit für die Elektroporation.

2. Elektroporation der Zellen in 96-well Platten

Der 96-well Platte Elektroporation ermöglicht die Wiederholungen für alle vier Behandlungen zusammen elektroporiert werden.
Transfer 150 ul der Zellsuspension in die Vertiefungen einer 96-well Platte Elektroporation.
Legen Sie die Platte in der MXcell Elektroporation Platte Kammer und den Deckel schließen.
Elektroporieren mit den Einstellungen für die Zell-Linie und Puffer verwendet wird optimiert. Diese Zellen sind elektroporiert mit einem exponentiellen Abfall Welle mit Geräteeinstellungen von 250 V, 350 uF und 1000 Ω Widerstand.
Nach der Elektroporation abgeschlossen ist, Pipette nach oben und unten leicht in jede Vertiefung zu mischen und dann übertragen Zellen einer Gewebekultur Platte mit vorgewärmten Medien. Namalwa Zellen werden in RPMI (Life Technologies) mit 7,5% FCS und 1% Pyruvat ergänzt gewachsen.
Kontrollproben, die nicht elektroporiert werden von den verbleibenden Zellsuspension aufgenommen und zu Kulturschalen vorgewärmtes Kulturmedium identisch mit dem elektroporiert Zellen.
Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO _2.
Nach 24 Stunden wurde eine Reihe von Zellen mit 10 ng / ml Endkonzentration rekombinanten IL-4 (R & D Systems) induziert. Der zweite Satz von Kontroll-Zellen erhalten nur zusätzliche Medien. Alle Zellen sind weitere 24 h bei 37 ° C und 5% CO ₂ inkubiert.

3. Extract und kontrollieren RNA

Nach insgesamt 48 Stunden auf Wachstum, zählen Sie die Zellen in jeder Vertiefung und Transfer ein Aliquot aus jedem Well ein Mikrozentrifugenröhrchen für die RNA-Extraktion, und frieren ein zweites Aliquot für Western-Blot oder andere Protein-Analyse.
Centrifuge Proben die Zellen zu pelletieren, und dann zu entfernen und den Überstand verwerfen aus jedem Röhrchen.
Fahren Sie mit der RNA-Extraktion. Wir verwenden in der Regel die Aurum Gesamt-RNA-Kit (Bio-Rad) nach dem mitgelieferten Protokoll.
Bei der Überwachung von siRNA-vermittelten Gen-Knockdown ist es besonders wichtig, um RNA-Qualität zu überprüfen, weil abgebaut RNA irreführenden Ergebnissen führen wird. Die 260/280 Ratio weist nicht auf RNA-Integrität daher ist es wichtig, die Proben auf einem Gel oder Mikrofluidikvorrichtung zu bestätigen RNA nicht abgebaut laufen.
Um zu beurteilen, die Qualität und Quantität in einem Schritt, werden diese Proben analysiert mit dem Experion automatisierte Elektrophorese-System (Bio-Rad) werden.
First-, Wärme-Proben. Dann, prime, laden und Wirbel der Experion RNA-Chip. Legen Sie die Chips in das Experion Elektrophorese-Station und starten Sie laufen.
Nach dem Lauf abgeschlossen ist, wird die Software Experion Ergebnisse automatisch in Form von ein Elektropherogramm, Ergebnisse Tabelle (dh zeigt RNA-Konzentration, die ribosomale-Verhältnis und die RNA Qualitätsindikator Zahl), und virtuelle Gel (die sieht ähnlich aus wie ein traditionelles RNA Gel). Hohe Qualität der Gesamt-RNA Proben werden typischerweise eine RQI von 8-10.
4. Real-time PCR
1. Nach Überprüfung der RNA-Qualität, mit der cDNA Reaktionen ablaufen. Dieses Experiment verwendet die iScript one-step RT-PCR-Mix (Bio-Rad) zur cDNA-Synthese und real-time PCR in einer Reaktion zu kombinieren.
2. Machen Sie einen Master-Mix enthält alle Reaktionskomponenten außer der RNA-Templates für jedes Primer-Set, und verteilen diese in die PCR-Platte.
3. Nach Verdünnen der RNA, um eine gleichmäßige Konzentration, fügen Sie die RNA-Proben in die entsprechenden Vertiefungen. Jede Reaktion ist in dreifacher Ausfertigung gesetzt.
4. Verschließen Sie die Platte, und legen Sie sie in die CFX384 real-time PCR-System (Bio-Rad). Wählen Sie das entsprechende Protokoll und beginnen den Lauf.
5. Nachdem der Lauf beendet ist, wird die Genexpression durch den Vergleich der Genexpression des Gens von Interesse normalisiert, um eine Referenz-Gen in Zellen mit experimentellen siRNA auf die gleiche Normalisierung der Zellen durch Elektroporation mit einem Kontroll-siRNA elektroporiert bestimmt.
5. Die Analyse der siRNA Knockdown
1. Die Expression von CCL17 überwacht wurde mittels quantitativer real-time PCR, um die Rolle des Transkriptionsaktivators STAT6 in IL-4 abhängige Induktion von CCL17 zu untersuchen. Für dieses Experiment wurde GAPDH als Referenz-Gen verwendet. Alternate Verweis Gene oder mehrere Referenz-Gene können in der gleichen Weise eingesetzt werden.
2. Die CFX-Manager-Software automatisch CCL17 Ausdruck Ausdruck der Referenz-Gen aus derselben Probe normalisiert und automatisch verglichen die resultierende normalisierte Werte zu Behandlungen durch einfaches Auswählen GAPDH als "Referenz" und die Kontrolle der Behandlung (Kontroll-siRNA ohne IL-4-Induktion) als Kontrolle "Kontrolle" in die experimentellen Einstellungen Fenster der CFX-Manager-Software.
3. Ohne IL-4-Induktion, die Transkription von CCL17 blieb niedrig, konstitutive Niveau vergleichbar mit der Kontrolle der Behandlung.
4. Zellen mit IL-4 induziert und Beibehaltung einer normalen STAT6 Weg (dh Kontroll-siRNA oder transfizierten Kontrollzellen Behandlungen) zeigte 8-10 fache Induktion von CCL17 Ausdruck.
5. Zellen mit IL-4, aber mit STAT6 Ausdruck gehemmt durch die Einführung von entweder STAT6 siRNA induzierte zeigten nur etwa 2-fach höher CCL17 Ausdruck als die induzierten Zellen bestätigt die Rolle der STAT6 in der IL-4 induzierte Expression von CCL17.
6. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Übersicht über die IL-4-Signalweg.
A) Die Bindung von IL-4 an seinen Rezeptor führt zur Dimerisierung und Aktivierung von STAT6. Aktiviert STAT6 in den Zellkern und aktiviert die Transkription seiner Zielgene, wie CC17.
B) Ohne IL-4-Induktion wird die Transkription von CCL17 bei niedrigen, konstitutive Niveau bleiben.
C) Nach dem siRNA-vermittelten Inaktivierung des Gens STAT6, sollte die Behandlung mit IL4 zu wenig oder gar keine Erhöhung der CCL17 Expression führen.

Abbildung 2. Induktion von CCL17 durch IL4 von verschiedenen Bedingungen durch quantitative real-time PCR gemessen.
A) Die Proben ohne IL-4 angewachsen war eine geringe konstitutive Niveau der Expression, unabhängig von der Genexpression.
B) Wie in grün und blau dargestellt, reagiert Kontrollproben in der Regel auf die Behandlung mit IL-4, mit eine 8-10 fache Induktion von CCL17. Allerdings Zellen mit siRNAs STAT6, in rot und pink gezeigt transfiziert, hatte CCL17 Ausdruck in Reaktion auf IL-4 vermindert, unterstützt die Idee, dass STAT6 spielt eine Rolle in der IL-4 induzierte Expression von CCL17.

Discussion

Dieser Artikel wurde gezeigt, wie siRNAs in eine schwierige elektroporieren Aussetzung Zelllinie transfizieren und wie die Genexpression in diesen Zellen folgen. Wenn Sie dieses Verfahren es ist wichtig sich daran zu erinnern, die Dinge so konsequent wie möglich in allen Proben zu halten.