Summary
Dieser Artikel zeigt die Präparation und Inkubation von Kaninchen-Netzhaut und Partikel-vermittelte Gentransfer von Plasmiden GFP oder eine Vielzahl von subzellulären Marker in retinalen Ganglienzellen.
Abstract
Organotypischen Kultur von funktionellen neuronalen Gewebe sind wichtige Werkzeuge in der neurobiologischen Forschung. Idealerweise sollte ein solches System kompatibel sein mit bildgebenden Verfahren, genetische Manipulation und elektrophysiologische Ableitung. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache Interphase Gewebekultursystem für erwachsene Kaninchen Netzhaut, die keine spezielle Ausrüstung und nur sehr wenig Wartung benötigt. Wir zeigen die Präparation und Inkubation von Kaninchen-Netzhaut und Partikel-vermittelte Gentransfer von Plasmiden GFP oder eine Vielzahl von subzellulären Marker in retinalen Ganglienzellen. Kaninchen Netzhaut kultivierten diese Weise am Leben erhalten für bis zu 6 Tage mit sehr wenig Veränderungen der allgemeinen anatomischen Struktur oder die Morphologie der einzelnen Ganglien-und Amakrinzellen werden.
Protocol
Herstellung Gen-Kanone Kugeln (GOLD)
- Machen 100X PVP (0,5-Promillegrenze) in 100% EtOH.
- Abwiegen 30mg BioRad 1,6 Micron Mikroträger gold und legen Sie sie in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
- Berechnen Sie die Menge an Plasmid benötigt, um eine Konzentration von 0,5-3 ug Plasmid / mg Gold zu geben, und statt das Plasmid in das Rohr mit dem Gold Mikroträger. Kombinieren Sie mehrere Plasmide, wenn nötig.
- Bringt Volumen von Plasmid zu 100 ul mit destilliertem Wasser.
- 100 l 0,05 M Spermidin in die Röhre. Vortex Tube 30 Sekunden.
- Vortex 1 Minute bei voller Geschwindigkeit. Ultraschallbad für 3-5 Minuten ..
- Dry eine angemessene Länge von Tefzel Schlauch in einem Biorad PDS-1000/He Gerät für 15 Minuten.
- Nach der Beschallung, Vortex für 1-2 Minuten bei voller Geschwindigkeit. Reduzieren Sie das Tempo langsam, damit die Röhre geöffnet, während Vortexen werden.
- Geben Sie 100 ul 1 M CaCl 2 langsam auf das Rohr tropfenweise unter Vortexen.
- Lassen Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
- Make 5 Micron Filter.
- Nehmen Sie zwei 5ml Spritzen ohne Nadeln.
- Entfernen Sie den Kolben, und entfernen Sie die schwarzen Kappen. Unter einer kleinen Schere, schnitt ein Teil der schwarzen Kappe, um einen Ring zu geben. Wiederholen Sie auf der anderen Kolben, um netto zwei Ringe.
- Sandwich eine 5 Micron (Small Parts, Inc. Nylonfilter, ½ Zoll Durchmesser) Filter zwischen den beiden Ringen, und schieben Sie das Sandwich in die Spitze der Spritze.
- Dangle Spritze über einen 50ml Erlenmeyerkolben.
- Nach 10 Minuten Vortex das Röhrchen für 30 Sekunden.
- Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 30 Sekunden und das Pellet bewahren.
- Add 1 ml 100% EtOH zu Pellets. Verwenden Sie Pipettenspitze zum Aufbrechen der Pellet-und Vortex 30 Sekunden. Spin 30 Sekunden und entfernen EtOH. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
- Add 1 ml 100% EtOH, um das Pellet (break up mit Spitze). Legen Sie diese in die 5 Micron Filter und let it flow durch die Schwerkraft in die 50ml konischen Rohr. Verwenden Sie mehr EtOH bei Bedarf zu waschen Rohr oder Hilfe bei der Durchströmung.
- Spin der 50ml Tube bei 2000rpm in Zentrifuge für 5-10 Minuten. Überstand entfernen, speichern Pellet.
- Abhängig von der gewünschten Dichte der Mikropartikel erforderlich, fügen Sie 800μl-1.5ml 100% EtOH und entsprechende 8 ul-15 ul PVP-Lösung.
- Swirl und sofort an den Biorad PDS-1000/He Apparat gehen.
- Biorad PDS-1000/He Apparat
- Trennen Sie das Verbindungsrohr der N2-Gas-Tank, die Trockenrohr
- Nehmen Sie Trocknung Tefzel Schlauch von der Maschine
- Stecken Sie ein Ende in die 50ml konischen Rohr, und fügen Sie eine Spritze an das andere Ende des Schlauchs. Saugen braunen Schlamm in die Mitte des Rohres.
- Das Rohr wieder einsetzen.
- Wait (ohne Rotation) für 4 Minuten
- Nach 4 Minuten absaugen EtOH langsam und vorsichtig, was sicher nicht Mikroträger stören.
- Drehen Sie den Schlauch für 1 Minute.
- Nach 1 Minute, schließen Sie das Verbindungsrohr der N 2-Gas-Tank, die Trockenrohr und lassen Sie Schlauch trocken für 15 Minuten.
- Nach 15 Minuten, schneiden Sie den Schlauch an Kugel Größe sofort verwendet werden oder bei 4 ° C gelagert in einem Exsikkator. Kugeln können bis zu 3 Monate gelagert werden.
Vorbereitung der Gene-Gun
- Legen Sie Kugeln in einer Patrone. Jedes Stück der Netzhaut kann mit 1-3 Kugeln abgeschossen werden.
- Setzen Sie die Patrone in das Gen-Kanone und befestigen Sie die Waffe mit einem Helium-Quelle. Stellen Sie den Druck bis 110 Psi.
Vorbereitung der Medien
- Dissection Medium
1 Flasche Ames-Lösung (Sigma, 8,8 g) 1,9 g Natriumbicarbonat 10 ml 1% Pen / Strep / L-Glutamin (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml destilliertem Wasser auf 1 Liter ------------------------------- 1 Liter - Filtern Sie die Dissektion Medium mit einem 0,22 um Filter.
- Inkubationsmedium (500ml)
485 ml des gefilterten Dissektion Medien 5 ml 1% N2 ergänzen (Gibco / Invitrogen) 10ml 1% Pferdeserum (Sigma) 500 ul von Phenolrot -------------------------------------------------- - 0,5 L - Filter Inkubationsmedium mit einem 0,22 um Filter.
- Bubble-O 2 in die Dissektion Medium für 15 Minuten vor Beginn der Netzhaut Ernte-Protokoll.
Vorbereitung der Inkubation Kammern für Netzhaut
- Unter einer Haube, füllen mehrere 60 mm tiefen Tellern (Inkubationskammern, Nunc) mit 25 ml Inkubationsmedium. Die Zahl der Gerichte hängt von der Anzahl der retInAs benötigt.
- Legen Sie einen Filter stehen in jedem tiefen Teller. Nur die Spitzen der Stand sollte nicht getaucht werden.
- Legen Sie alle tief in den Brutschrank, bis die Netzhaut bereit sind.
- Füllen Sie zwei 100 mm-Petrischalen und bringen die Dissektion Bank.
Zubereitung von Kaninchen-Retina
- Sacrifice ein Kaninchen nach festgelegten Protokollen. Die folgenden nicht unter einem Abzug durchgeführt werden.
- Mit abgewinkelten Schere, legen Sie sie hinter dem Auge in die Augenhöhle des Kaninchens, Schneiden der Membranen und optische Nerv, der für das Auge verbunden sind.
- Heben Sie die Augen und waschen Sie es mit Sauerstoff Dissektion Medien.
- Ort des Auges (Hornhaut nach oben) in die Vertiefung ein Auge Hobel und den Deckel schließen.
- Legen Sie das Blatt horizontal direkt unter dem Deckel. In einer geschmeidigen Bewegung, ziehen Sie die Klinge über das Auge abzuschneiden der Hornhaut, so dass ein Auge Tasse.
- Mit einer Pinzette entfernen die Netzhaut des Auges Allesschneider gut und legen Sie es auf ein Filterpapier.
- Entfernen Sie den Glaskörper und die Linse durch Klemmen einer Gegend nahe dem abgetrennten Sehnerv und Ziehen nach hinten auf ein Filterpapier. Mehrmals wiederholen, bis fast alle der Glaskörper entfernt und die Augenmuschel sieht deflationiert.
- Legen Sie Augenmuschel in eine Petrischale mit Dissektion Medien zu waschen.
- Schneiden Sie die Augenmuschel in die gewünschte Anzahl von Stücken (maximal 5 Stück).
- Nehmen Sie ein Stück Augenmuschel und legen Sie sie unter dem Mikroskop.
- Klemmen Sie die Sklera und Aderhaut leicht zusammen am Rande der Netzhaut mit einer Pinzette. Mit der anderen Hand, mit einem feinen Pinsel nach rechts zwischen der Aderhaut und der Netzhaut Bürste.
- Mit kurzen, sanften Bewegungen, necken die Netzhaut von der Aderhaut, bis es gelöst wird.
- Cut 1 Zoll off einer sterilen Transferpipette. Verwenden Sie diese zu saugen die Netzhaut und Ort in eine Petrischale von Inkubationsmedium zu waschen.
- Mit einer weiteren sterilen Transferpipette mit 1 Zoll abgeschnitten, sorgfältig Transfer der Netzhaut auf einen 0,4 &mgr; Millicell Filter (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Verwenden Sie eine Bürste zur Ausrichtung der Netzhaut mit den Ganglienzellen Seite nach oben.
- Flatten aus der Netzhaut durch Bürsten leicht an den Rändern der Netzhaut. Minimieren Sie berühren den Ganglienzellen mit dem Pinsel so viel wie möglich.
- Entfernen Sie überschüssiges Medium auf Filter mit einer Transferpipette.
- Mit einer Pinzette, übertragen Sie die Filter auf einer modifizierten suctioner. Malen suctioner 2-3 mal alle Inkubationsmedium aus dem Filter entfernen.
Gene Spritz-und Inkubation der Netzhaut
- Unter einer Haube, statt jedes der Netzhaut-haltigen-Filter auf den Filter steht in der 60 mm tiefen Tellern (Inkubationskammern).
- Stellen Sie sicher, dass das Medium in Kontakt mit der Unterseite des Filters und dass das Medium nicht über die Seiten des Filters auf die Netzhaut spill ist. Der Filter sollte als Schnittstelle zwischen der Netzhaut und mittlere handeln.
- Schießen Sie jedes Stück der Netzhaut mit zwei Kugeln. Legen Gen-Kanone direkt über Gewebe, etwa 3-4 cm entfernt.
- Legen Sie alle Inkubationskammern auf einem Shaker in den 35 bis 37 ° C Inkubator.
- Ersetzen Sie mit Inkubationsmedium jeden Tag. Die Netzhaut kann für maximal 6 Tage bebrütet werden.
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Discussion
1. Was kann ich mit dieser Methode zu tun?
- Siehe Zellmorphologie deutlich.
- Label-Zellen, von ihnen zu erfassen.
- Überexprimieren Proteine, wie PSD95, sondern auch andere Proteine, die die Zelle die Reaktion modulieren, zB Ionenkanäle, Rezeptoren.
- Express inhibitorischen RNAs.
2. Wie lange kann ich erwachsenen Netzhaut?
- 4 Tage ist kein Problem für erwachsene Kaninchen. Nach sechs Tagen wurden die Zellen aussehen "krank", dh die Axone einfahren, sehen Sie Anschwellen der Dendriten und die Aufnahme von Licht Reaktionen unzuverlässig wird (nur ~ 50% der Zellen erwiesen sich als Licht-responsive nach dieser Zeit.
- Wir behalten Maus Netzhaut für 2 Tage. Mäuse sind viel schwieriger, weil die Netzhaut vaskularisiert sind, und auch dicker als Kaninchen Netzhaut.
3. Wie kann ich sicherstellen, dass Ihre Netzhaut ist nach dieser Zeit gesund?
- Der Goldstandard ist von ihnen die Aufnahme. Ganglienzellen sollte noch auf Licht reagieren. Sie sollten Ihre Gewebe vor Licht zu schützen während der Inkubation zu vermeiden Bleichen der Photopigment, weil Sie auf die Netzhaut vom Pigmentepithel sezieren für die Inkubation haben.
- Wir gelegentlich auch Mikroelektroden-Array Aufnahme verwendet, um unsere Netzhaut zu testen.
4. Warum wollen Sie nur ein paar Zellen in der Netzhaut zu einem Zeitpunkt, zu manipulieren?
- Einige Fragen können nicht anders behandelt werden. Betrachten Sie zum Beispiel GABA-Rezeptoren auf einer Ganglienzelle. Sie könnten GABA-Blocker, aber Sie würden alle GABAergen Übertragung in der Netzhaut hemmen, nicht nur die Eingabe für die Zelle, die Sie interessiert sind in. Es kann sehr schwierig, zwischen einer Wirkung auf die Zelle in allem zu unterscheiden, und vor allem "Netzwerk-Effekte "auf die ganze Netzhaut.
- Wenn Sie auf die Morphologie deutlich sehen möchten, können Sie nicht Etiketten alle Zellen, sonst bekommst du nur ein einziges Durcheinander.
5. Eignet sich diese Methode als eine Population Fleck?
- Nr. Gene gunning ist ein Zufallsverfahren. Sie erhalten viele Ganglienzellen, viele Vertriebene Amakrinzellen, einige Muller Zellen, und viel weniger von allen anderen Zelltypen.
6. Gibt es irgendwelche "Tricks" Ich muss es wissen, damit es funktioniert?
- Nicht wirklich. Aber es ist wichtig, dass Sie die Dissektion der Netzhaut zu tun relativ schnell, so dass Sie Ihre Stücke auf dem Filter in weniger als 30 Minuten. Die Stücke sollten nicht zu klein sein, etwa ein Quadratzentimeter in Ordnung ist. Erwarten Sie 3-4 Stücke von einem Kaninchenauge.
- Halten Sie Ihre Werkzeuge Dissektion strikt fern von allem, was in Kontakt mit Fixiermittel und andere aggressive Chemikalien.
- Versuchen Sie, Ihre Inkubator bis 35 ° C statt 37, so die Netzhaut nicht zu heiß wird.
- Sie brauchen nicht zu Wachstumsfaktoren wie BDNF zu Ihrem Medium hinzufügen, zumindest haben wir es nicht tun routinemäßig, aber Sie sollten N2 zu ergänzen, zu 1% Pferdeserum und Antibiotika zu verwenden. Wir bieten Ihnen eine Liste aller Dinge, die Sie & 'als zusätzliche Datei in dieser Dokumentation benötigen werde.
7. Könnten Sie Gen-Kanone andere Sachen, anstatt Plasmide?
- Ja, wir haben Farbstoff-konjugierten Dextrane oder DiI und DIO verwendet. Aber könnten Sie Kalzium-Indikator-Farbstoffen, oder so ziemlich alles, was Sie beschichten können auf Gold-oder Wolfram-Geschosse.
8. Wo liegen die Grenzen?
- Vor allem Zeit. Sie haben an den Sehnerv, so dass die Ganglienzellen schließlich degenerieren bedeutet geschnitten. Dies ist nicht ein Problem für bis zu 6 Tage, aber danach hätten wir kein Vertrauen in die Netzhaut nicht mehr. Nun, wenn Sie nur wollen, GFP oder eine ausdrückliche einige andere Zell-Füllung Marker ist einer Inkubationszeit von 2-3 Tagen genug, aber in einigen Fällen, wie wenn Sie wollen inhibitorischen RNAs zu äußern, die Wirkung kann 4 oder mehr Tage zu zeigen. Hier haben Sie die Timeline im Auge behalten.
9. Welche anderen wissenschaftlichen Arbeiten sollte man beachten?
- In der Netzhaut Feld sicherlich Rachel Wong Labor an der Washington University. Es gibt auch eine Menge Arbeit, die Menschen in anderen Systemen, wie Hippocampus Stück Vorarbeit geleistet haben. Wir behaupten nicht in der Lage sein einen vollständigen Überblick über die Literatur zu geben, sondern prüfen Sie die Papiere in der Referenzliste.
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