Summary
Questo articolo dimostra la dissezione e l'incubazione di retina di coniglio e di particelle-mediato trasferimento genico di plasmidi codifica GFP o una varietà di marcatori subcellulari in cellule gangliari della retina.
Abstract
Sistemi di coltura organotipica funzionale di tessuti neurali sono strumenti importanti nel campo della ricerca neurobiologica. Idealmente, un tale sistema dovrebbe essere compatibile con tecniche di imaging, la manipolazione genetica, e la registrazione elettrofisiologica. Qui vi presentiamo un semplice tessuto del sistema interfase cultura per la retina di coniglio adulto che non richiede attrezzature specializzate e di pochissima manutenzione. Dimostriamo la dissezione e l'incubazione di retina di coniglio e di particelle-mediato trasferimento genico di plasmidi codifica GFP o una varietà di marcatori subcellulari in cellule gangliari della retina. Retine di coniglio colto questo modo può essere mantenuto in vita per un massimo di 6 giorni con molto piccoli cambiamenti della struttura anatomica generale o la morfologia delle singole cellule gangliari e amacrine.
Protocol
Fare gene proiettili pistola (GOLD)
- Fai 100X PVP (0.5mg/ml) in 100% EtOH.
- Pesare 30 mg di BioRad 1,6 oro Micron microcarrier e metterla in una provetta eppendorf da 1,5 ml.
- Calcolare la quantità di plasmide necessaria per ottenere una concentrazione di 0,5-3 mg oro plasmide / mg, e posizionare il plasmide nel tubo con il microcarriers oro. Combinare plasmidi diversi, se necessario.
- Portare il volume del plasmide di 100 l con acqua distillata.
- Aggiungere 100 ml di spermidina 0,05 m nel tubo. Tubi vortex 30 secondi.
- Vortex 1 minuto a piena velocità. Ultrasuoni per 3-5 minuti ..
- Secco un congruo spazio di tubi Tefzel in un apparato PDS-1000/He Biorad per 15 minuti.
- Dopo sonicazione, vortex per 1-2 minuti alla massima velocità. Ridurre la velocità lentamente per permettere al tubo di essere aperto mentre vortex.
- Aggiungere 100 ml di 1 M CaCl 2 lentamente la goccia tubo saggio mentre vortex.
- Lascia tubo a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Fare 5 filtro Micron.
- Prendete due siringhe da 5 ml senza aghi.
- Rimuovere il pistone, e staccare la berretti neri. Prendendo piccole forbici, tagliare una parte del cappuccio nero per dare un anello. Ripetere lo stantuffo altra rete due anelli.
- Panino a 5 Micron (parti piccole, Inc. filtro nylon, ½ pollici di diametro) filtro tra i due anelli, e spingere il panino nella punta della siringa.
- Siringa dondolare sopra un pallone da 50 ml conica.
- Dopo 10 minuti, il tubo vortex per 30 secondi.
- Centrifugare la provetta per 30 secondi e salvare il pellet.
- Aggiungere 1 ml di EtOH 100% a pellet. Usa punta della pipetta per rompere il pellet, e vortex 30 secondi. Spin 30 secondi e rimuovere EtOH. Ripetere altre 2 volte.
- Aggiungere 1 ml di EtOH 100% per il pellet (rottura con punta). Inserire questo in Micron filtro 5 e lasciarla fluire attraverso per gravità nel tubo da 50 ml conica. Utilizzare più EtOH come necessario per lavare via tubo o aiutare con flusso attraverso.
- Gira la 50ml tubo a 2000 giri in centrifuga per 5-10 minuti. Rimuovere il surnatante, salvare pellet.
- A seconda della densità desiderata microcarriers necessario, aggiungere 800μl-1,5 ml EtOH 100% e corrispondenti 8 microlitri-15 ul di soluzione PVP.
- Turbolenza e subito andare l'apparato PDS-1000/He Biorad.
- Biorad PDS-1000/He apparato
- Scollegare il tubo di collegamento del serbatoio del gas N2 al tubo di essiccazione
- Estrarre asciugatura tubi Tefzel dalla macchina
- Inserire un'estremità del tubo da 50 ml conica, e allegare una siringa all'altra estremità del tubo. Succhiare liquame marrone nel mezzo del tubo.
- Inserire di nuovo tubo nella macchina.
- Aspettare (senza rotazione) per 4 minuti
- Dopo 4 minuti, succhiano EtOH lentamente e con attenzione, facendo attenzione a non disturbare microcarriers.
- Ruotare il tubo per 1 minuto.
- Dopo 1 minuto, collegare il tubo di collegamento del serbatoio del gas N 2 al tubo di essiccazione e lasciare asciugare tubi per 15 minuti.
- Dopo 15 minuti, tagliare il tubo per le dimensioni dei punti da utilizzare immediatamente o conservato a 4 ° C in exsiccator. Proiettili possono essere memorizzati fino a 3 mesi.
Preparazione del gene-gun
- Proiettili posto in una cartuccia. Ogni pezzo di retina può essere sparato con proiettili 1-3.
- Inserire la cartuccia nel gene-gun e allegare la pistola ad una fonte di elio. Impostare la pressione a 110 Psi.
Preparazione dei terreni
- Dissezione di media
1 bottiglia Ames soluzione (Sigma, 8.8g) 1,9 g di sodio bicarbonato 10 penna ml 1% / strep / L-Glutammina (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml di acqua distillata per 1L ------------------------------- 1 litro - Filtrare il medium dissezione utilizzando un filtro di 0,22 micron.
- L'incubazione media (500ml)
485 ml di media dissezione filtrata 5 ml di supplemento N2 1% (Gibco / Invitrogen) 10ml 1% siero di cavallo (Sigma) 500 microlitri di rosso fenolo -------------------------------------------------- - 0.5 L - Filtrare il mezzo di incubazione utilizzando un filtro di 0,22 micron.
- Bubble O 2 nel mezzo dissezione per 15 minuti prima di iniziare la procedura di raccolta retina.
Preparazione delle camere di incubazione retina
- Sotto una cappa, riempire 60 piatti diversi mm di profondità (camere di incubazione, Nunc) con 25 ml di mezzo di incubazione. Il numero di piatti dipende dal numero di retINAS necessario.
- Posizionare un supporto filtro in ogni piatto profondo. Solo le punte molto dello stand non devono essere sommerse.
- Mettere tutti i piatti in profondità nel incubatrice fino a quando la retina sono pronti.
- 100 millimetri riempire due scatole Petri e portare in panchina dissezione.
Preparazione della retina di coniglio
- Sacrificare un coniglio secondo i protocolli stabiliti. Quanto segue non deve essere effettuata sotto una cappa.
- Con le forbici angolate, inserirlo dietro l'occhio nella cavità oculare del coniglio, tagliare le membrane e il nervo ottico che sono attaccati alla vista.
- Sollevare delicatamente l'occhio e lavarlo con i media dissezione ossigenato.
- Posto dell'occhio (cornea verso l'alto) nel pozzo di una affettatrice occhi e chiudere il coperchio.
- Posizionare la lama orizzontalmente a destra sotto il coperchio. In un movimento fluido, disegnare la lama attraverso l'occhio a tagliare la cornea, lasciando un oculare.
- Utilizzando pinze, rimuovere la retina dalla affettatrice occhi bene e posizionarlo su una carta da filtro.
- Rimuovere il vitreo e la lente di bloccaggio un'area vicino reciso il nervo ottico e tirando all'indietro su una carta da filtro. Ripetere più volte fino a quando quasi tutto il vitreo viene rimosso e la coppa occhio guarda sgonfiato.
- Luogo oculare in una capsula di Petri con i media dissezione da lavare.
- Tagliare l'oculare nel numero desiderato di pezzi (5 al massimo pezzi).
- Prendete un pezzo di oculare e mettetelo sotto il microscopio.
- Fissare la sclera e coroide leggermente insieme sul bordo della retina mediante pinze. Con l'altra mano, uso un pennello fine a pennello proprio tra la coroide e la retina.
- Utilizzando breve, movimenti dolci, stuzzicare la retina al largo della coroide fino a quando non si stacca.
- 1 pollice tagliato fuori una pipetta di trasferimento sterile. Usare questo per aspirare la retina e il luogo in una scatola Petri del mezzo di incubazione da lavare.
- Utilizzando un altro pipetta sterile di trasferimento con 1 pollice tagliato, trasferire accuratamente la retina su un 0,4 micron Millicell filtro (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Usare un pennello per orientare la retina con il lato rivolto verso l'alto delle cellule gangliari.
- Appiattiscono la retina mediante spazzolatura leggera sui bordi della retina. Ridurre al minimo contatto con lo strato di cellule gangliari con il pennello il più possibile.
- Rimuovere l'eccesso di media sul filtro con una pipetta di trasferimento.
- Utilizzando pinze, trasferire il filtro su un suctioner modificato. Disegnare sulla suctioner 2-3 volte per rimuovere tutti i mezzo di incubazione dal filtro.
Gene Gunning e di incubazione di retina
- Sotto una cappa, ogni luogo della retina contenenti filtri sul filtro si trova nel 60 piatti mm di profondità (camere di incubazione).
- Assicurarsi che il mezzo è in contatto con la parte inferiore del filtro e che il mezzo non versare sopra i lati del filtro sulla retina. Il filtro deve agire da interfaccia tra la retina e medie imprese.
- Spara ogni pezzo di retina con due proiettili. Luogo pistola gene direttamente al di sopra dei tessuti, a circa 3-4 cm di distanza.
- Mettere tutte le camere di incubazione su uno shaker nei 35 - 37 ° C incubatore.
- Sostituire con mezzo di incubazione ogni giorno. La retina può essere incubate per un massimo di 6 giorni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Cosa posso fare con questo metodo?
- Vedi morfologia cellulare in modo chiaro.
- Cellule etichetta per registrare da loro.
- Iperespressione di proteine, come PSD95, ma anche altre proteine che modulano la risposta della cellula, canali ionici ad esempio, recettori.
- Esprimere RNA inibitori.
2. Per quanto tempo posso tenere retina per adulti?
- 4 giorni non è un problema per i conigli adulti. Dopo sei giorni le cellule aspetto "malato", cioè gli assoni ritrattare, si vede il gonfiore dei dendriti e la registrazione di risposte luce diventa inaffidabile (solo circa il 50% delle cellule sono stati trovati ad essere luce-sensibile dopo tale termine.
- Abbiamo mantenuto il mouse retine per 2 giorni. I topi sono più difficili, perché le retine sono vascolarizzati, e anche più spesso di retina di coniglio.
3. Come faccio ad assicurarsi che la retina è in salute dopo questo tempo?
- Il gold standard è la registrazione da loro. Cellule gangliari dovrebbe comunque reagiscono alla luce. Si consiglia di proteggere il tessuto dalla luce durante l'incubazione per evitare il candeggio fotopigmento, perché si deve sezionare la retina fuori dell'epitelio pigmentato per l'incubazione.
- Occasionalmente utilizzato anche serie registrazione microelettrodo per testare la nostra retina.
4. Perché vuoi per manipolare solo poche cellule della retina alla volta?
- Alcune domande non può essere affrontata diversamente. Consideriamo per esempio i recettori GABA su una cella ganglio. Si potrebbe usare bloccanti GABA, ma si dovrebbe inibire tutte trasmissione GABAergica nella retina, non solo l'ingresso alla cella che vi interessa a. Può essere molto difficile distinguere tra un effetto su tale cellula, in particolare, e in generale "effetti di rete "sulla retina intero.
- Se volete vedere la morfologia chiaramente, non si può etichettare tutte le cellule, altrimenti si ottiene solo un pasticcio.
5. E 'questo metodo adatto come una popolazione macchia?
- Gunning Gene No. è una procedura casuale. Avrai molte cellule gangliari, molte cellule amacrine sfollati, alcune cellule Muller, e molto meno di tutti gli altri tipi di cellule.
6. Ci sono dei "trucchi" Devo sapere per farlo funzionare?
- Non proprio. Ma è importante che si fa la dissezione della retina in tempi relativamente brevi, in modo da avere i tuoi pezzi sul filtro in meno di 30 minuti. I pezzi non dovrebbe essere troppo piccola, circa un centimetro quadrato è ok. Aspettatevi 3-4 pezzi da un occhio di coniglio.
- Mantenere gli strumenti di dissezione rigorosamente lontano da tutto ciò che entra in contatto con fissativi ed altre sostanze chimiche aggressive.
- Provare a impostare il vostro incubatore a 35 ° C invece di 37, quindi la retina non viene mai troppo caldo.
- Non è necessario aggiungere fattori di crescita come il BDNF al vostro mezzo, almeno noi non lo facciamo di routine, ma si consiglia di utilizzare supplemento N2, 1% siero di cavallo, e antibiotici. Forniamo un elenco di tutte le cose che e 'avrai bisogno sotto forma di file supplementari a questa documentazione.
7. Potrebbe gene-gun altre cose, piuttosto che i plasmidi?
- Sì, abbiamo usato colorante coniugato destrani o DII e DIO. Ma si potrebbe utilizzare il calcio-indicatore di coloranti o qualsiasi cosa si può cappotto su proiettili d'oro o di tungsteno.
8. Quali sono i limiti?
- Prima di tutto, il tempo. Devi tagliare il nervo ottico, il che significa che le cellule gangliari alla fine degenerano. Questo non è un problema per un massimo di 6 giorni, ma dopo che non affiderei la retina più. Ora, se volete semplicemente esprimere GFP o qualche altro cellulare-riempimento marcatore, un'incubazione di 2-3 giorni è sufficiente, ma in alcuni casi, come quando si vuole esprimere RNA inibitori, l'effetto può prendere 4 o più giorni per spettacolo. Qui, dovete mantenere la timeline in mente.
9. Quale opera ricercatore altri si dovrebbe essere a conoscenza?
- Nel campo retina, certamente laboratorio Rachel Wong presso la Washington University. C'è anche un sacco di lavoro persone hanno fatto in altri sistemi, come la preparazione ippocampo fetta. Non pretendiamo di essere in grado di fornire una visione completa della letteratura, ma guardate le carte nella lista riferimenti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci STKE. 2000, (2000).
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
