Summary
В этой статье показано вскрытие и инкубации сетчатки кролика и частица-опосредованного переноса генов плазмид кодирования GFP или различных субклеточных маркеров в ганглиозных клеток сетчатки.
Abstract
Органотипической системы культуры функциональных нервных тканей являются важными инструментами в нейробиологических исследований. В идеале такая система должна быть совместима с методов визуализации, генетические манипуляции, и электрофизиологические записи. Здесь мы приведем простой межфазной культуры тканей система для взрослых сетчатки кролика, что не требует никакого специального оборудования и минимального обслуживания. Мы показываем, рассечение и инкубации сетчатки кролика и частица-опосредованного переноса генов плазмид кодирования GFP или различных субклеточных маркеров в ганглиозных клеток сетчатки. Кролик сетчатки культурный таким образом, может быть поддержана в течение 6 дней с очень небольшим изменением общей структуре анатомических или морфологии отдельных ганглиев и amacrine клеток.
Protocol
Создание генной пушки пулями (GOLD)
- Сделать 100X ПВП (0.5mg/ml) в 100% этанола.
- Взвесьте из 30 мг BioRad 1,6 золота Micron микроносителей и поместить его в трубку 1,5 мл Eppendorf.
- Рассчитать количество плазмиды, необходимых для получения концентрации 0,5-3 мкг плазмиды / мг золота, и место плазмиды в трубке с золотым микроносителях. Комбинат несколько плазмид, если необходимо.
- Довести объем плазмиды до 100 мкл дистиллированной воды.
- Добавить 100 мкл 0,05 М спермидина в трубку. Вихревые трубки 30 секунд.
- Vortex 1 минуты на полной скорости. Разрушать ультразвуком в течение 3-5 минут ..
- Сухой соответствующей длины Tefzel труб в аппарате Biorad PDS-1000/He течение 15 минут.
- После обработки ультразвуком, вихревые в течение 1-2 минут на полной скорости. Снизить скорость медленно, чтобы трубка будет открыт в то время как вортексе.
- Добавить 100 мкл 1 М CaCl 2 медленно трубки капля в то время как мудрые вортексе.
- Оставьте трубки при комнатной температуре в течение 10 минут.
- Сделайте 5 микрон фильтр.
- Возьмите два 5 мл шприца без иглы.
- Удалите поршень, и отделить черные шапки. Принимая маленькие ножницы, отрезали часть черной кепке, чтобы дать кольцо. Повторите с другой поршень с чистым два кольца.
- Сэндвич 5 микрон (мелкие детали, Inc нейлоновый фильтр, ½ дюйма в диаметре) фильтр между двумя кольцами, и нажимаем бутерброд на кончике шприца.
- Мотаться через шприц 50 мл коническую колбу.
- Через 10 минут, вихревые трубки в течение 30 секунд.
- Центрифуга трубку в течение 30 секунд и сохранить гранул.
- Добавить 1 мл 100% этанола для осаждения. Использование пипетки, чтобы разбить гранул, и вихрь 30 секунд. Спиновые 30 секунд и снять этанола. Повторить еще 2 раза.
- Добавить 1 мл 100% этанола в гранулах (перерыв с наконечником). Место это в 5 микрон фильтр и дайте ему течь через под действием силы тяжести в 50 мл коническую трубку. Используйте больше этанола, сколько необходимо для промыть трубы или помочь с потоком до конца.
- Спиновые 50мл трубки при 2000 оборотов в минуту в центрифуге в течение 5-10 минут. Удалить супернатант, за исключением гранул.
- В зависимости от желаемой плотности микроносителях необходимо, добавьте 800μl-1,5 мл 100% этанола и соответствующих 8 мкл-15 мкл раствора ПВП.
- Swirl и сразу же пойти в аппарате PDS-1000/He Biorad.
- Biorad PDS-1000/He аппарата
- Отсоедините трубку, соединяющую бак N2 газа в трубке сушки
- Выньте сушки Tefzel трубы от машины
- Вставьте один конец в 50 мл коническую трубку, и присоединить шприц к другому концу трубы. Соси коричневого шлама в середине трубы.
- Вставьте трубку обратно в машину.
- Wait (без вращения) в течение 4 минут
- После 4-х минут, отсасывать этанола медленно и осторожно, стараясь не нарушить микроносителях.
- Поворот трубы на 1 минуту.
- Через 1 минуту подключения трубки, соединяющей N 2 бензобак в сушильную трубку и пусть трубы высохнуть в течение 15 минут.
- Через 15 минут, разрезать трубы, чтобы пуля размер будет использоваться сразу или хранить при температуре 4 ° С в эксикаторе. Пули могут храниться до 3 месяцев.
Подготовка генной пушки
- Место пули в картридже. Каждая часть сетчатки могут быть сняты с 1-3 пуль.
- Вставьте картридж в генной пушки и прикрепить пистолет к гелия источник. Установить давление до 110 пси.
Подготовка средств массовой информации
- Препарирование среда
1 бутылка Эймс решение (Sigma, 8.8g) 1,9 г натрия гидрокарбоната 10 мл 1% пера / стрептококк / L-глютамин (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 мл дистиллированной водой до 1 л ------------------------------- 1 литр - Фильтры рассечение среды с использованием 0,22 мкм фильтр.
- Инкубационный среде (500 мл)
485 мл с фильтром СМИ рассечение 5 мл 1% N2 дополнения (Gibco / Invitrogen) 10 мл 1% лошадиной сыворотки (Sigma) 500 мкл фенола красного -------------------------------------------------- - 0,5 л - Фильтры среду инкубации использованием 0,22 мкм фильтр.
- Bubble O 2 в среде рассечение в течение 15 минут перед началом протокола сетчатки уборки урожая.
Подготовка инкубации камеры для сетчатки
- Под капотом, заполнить несколько 60 мм в глубину блюда (инкубационный камер, Nunc) с 25 мл инкубационной среды. Количество блюд зависит от числа отставкеInAs необходимости.
- Место фильтр стоять в каждую глубокую тарелку. Только самые кончики стоять не должен быть погружен в воду.
- Поместите все глубокие блюда в инкубаторе до сетчатки готовы.
- Заполните два 100 мм чашки Петри и довести до вскрытия скамейке.
Подготовка кролика сетчатки
- Жертва кролика в соответствии с установленными протоколами. Следующие не должна быть выполнена под капотом.
- С угловыми ножницами, вставьте его за глаза в глазнице из кролика, резка оболочки и зрительного нерва, которые прикреплены к глазу.
- Аккуратно выньте глаз и промойте его кислородом СМИ рассечение.
- Место глаза (роговица вверх) в колодец глаз резки и закрыть крышкой.
- Место лезвием горизонтально прямо под крышкой. В одном движении, рисовать лезвием поперек глаз, чтобы отрезать роговицы, в результате чего глаз чашку.
- Использование щипцов, удалить сетчатку глаза от среза хорошо и поместить его на фильтровальную бумагу.
- Удаление стекловидного тела и линзы, зажимая области около разорвала зрительного нерва и потянув назад на фильтровальную бумагу. Повторите несколько раз, пока почти все стекловидное удаляется и наглазник выглядит спущена.
- Место глаз чашки в чашку Петри с рассечением СМИ, чтобы помыться.
- Вырезать глаза чашу в желаемое количество штук (5 штук максимум).
- Возьмите одну часть глаза чашку и поместить его под микроскопом.
- Зажим склеры и сосудистой оболочки легко собираются на краю сетчатки использованием щипцов. С другой стороны, использование тонкой кистью, чтобы кисть правой между сосудистой оболочки и сетчатки.
- Использование коротких, нежных движений, дразнить сетчатки с сосудистой оболочкой, пока не отрывается.
- Вырезать 1 дюйм от стерильной пипетки передачи. Используйте это, чтобы подлизываться сетчатки и положите в чашку Петри в среде инкубации мыть.
- Используя другой стерильной пипетки передачи с 1 дюйм отрезать, тщательно передачи сетчатки на 0,4 мкм Millicell фильтром (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Используйте кисточку, чтобы ориентировать сетчатке стороны ганглиозных клеток вверх.
- Свести из сетчатки кистью слегка по краям сетчатки. Свернуть трогательные слой ганглиозных клеток с помощью кисти как можно больше.
- Удалите излишки среды на фильтр с передачей пипетки.
- Использование щипцов, передачи фильтра на изменение suctioner. Нарисуйте на suctioner 2-3 раза, чтобы удалить все среде инкубации с фильтром.
Торкрет Гена и инкубации сетчатки
- Под капотом, место каждого из сетчатки содержащих-фильтров на фильтр стоит в 60 мм в глубину блюда (инкубационный камеры).
- Убедитесь, что среда находится в контакте с нижней фильтр и что среда не перекинуться стороны фильтра на сетчатку. Фильтр должен выступать в качестве интерфейса между сетчаткой и среды.
- Съемка каждой части сетчатки с двумя пулями. Место генной пушки прямо над ткани, около 3-4 см прочь.
- Поместите все камеры инкубации на шейкере в 35 - 37 ° C инкубатора.
- Замените среду инкубации с каждым днем. Сетчатки может быть инкубировали в течение не более 6 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Что я могу сделать с помощью этого метода?
- Смотрите морфологии клеток ясно.
- Этикетка клетки для записи на них.
- Гиперэкспрессией белка, как и PSD95, но и других белков, которые модулируют ответ клетки, например, ионные каналы, рецепторы.
- Экспресс тормозных РНК.
2. Как долго я могу держать взрослого сетчатки?
- 4 дня это не проблема для взрослого кролика. После шести дней клетки выглядят "больной", то есть аксоны отказаться, ведь опухоль дендритов и регистрации света ответов становится ненадежным (только ~ 50% клеток оказались свет проблематику после этого времени.
- Мы продолжали мыши сетчатки в течение 2 дней. Мыши труднее, потому что сетчатка являются васкуляризированной, а также толще, чем кролик сетчатки.
3. Как мне убедиться, что ваш сетчатки здоровых по истечении этого времени?
- Золотой стандарт записи от них. Ганглия клетки должны по-прежнему реагируют на свет. Вы должны защитить вашу ткань от света во время инкубации, чтобы избежать отбеливания фотопигмент, потому что вы должны анализировать сетчатки от пигментного эпителия для инкубации.
- Иногда мы также использовали записи микроэлектрода массив для проверки нашей сетчатки.
4. Почему вы хотите управлять только несколько клеток в сетчатке за один раз?
- Некоторые вопросы не могут быть решены иначе. Рассмотрим, например, ГАМК рецепторы ганглиозных клеток. Вы можете использовать ГАМК-блокаторы, но вы бы подавлять все ГАМКергических передачи в сетчатке, а не только вход в клетку вы заинтересованы Это может быть очень трудно отличить влияние на эту ячейку, в частности, и в целом "сетевой эффект "В целом сетчатке.
- Если вы хотите увидеть морфологии ясно, что вы не можете маркировать все клетки, в противном случае вы просто получите беспорядок.
5. Является ли этот метод подходит в качестве населения пятно?
- Количество генов торкрет является случайной процедуры. Вы получите много ганглиозных клеток, многие перемещенные amacrine клеток, некоторые клетки Мюллера, и уж тем более всех других типов клеток.
6. Есть ли какие "уловки" Я должен знать, чтобы заставить ее работать?
- Не совсем так. Но важно, что вы делаете рассечение сетчатки довольно быстро, так что у вас есть штук на фильтр менее чем за 30 минут. Части не должны быть слишком маленькими, около одного квадратного сантиметра в порядке. Ожидайте 3-4 шт от одного кролика глаз.
- Храните ваши инструменты вскрытия строго от всего, что входит в контакт с фиксаторов и других агрессивных химикатов.
- Попробуйте настроить инкубаторе до 35 С, а не 37, так что сетчатке никогда не становится слишком жарко.
- Вам не нужно добавлять факторов роста, как BDNF к среде, по крайней мере, не делайте это регулярно, но вы должны использовать N2 добавка, 1% лошадиной сыворотки и антибиотики. Мы предоставляем список всех вещей, которые вы и будете нуждаться в качестве дополнительного файла в этой документации.
7. Не могли бы вы гена-пушечный другие вещи, а не плазмиды?
- Да, мы использовали краситель-сопряженных декстранов или DII и Дио. Но вы могли бы использовать кальций-индикатор красителей, или почти все, что вы можете пальто на золотые или вольфрамовые пули.
8. Каковы ограничения?
- Прежде всего, времени. Вам придется делать зрительного нерва, а это значит, что ганглиозные клетки в конечном итоге вырождается. Это не проблема на срок до 6 дней, но после этого мы не стал бы доверять сетчатки больше. Теперь, если вы просто хотите, чтобы выразить GFP или какой-либо другой клетке заполнения маркер, инкубации 2-3 дней вполне достаточно, но в некоторых случаях, например, когда вы хотите выразить тормозные РНК, эффект может иметь 4 и более дней шоу. Здесь, вы должны иметь в виду сроки.
9. Какие работы других исследователей следует ли быть в курсе?
- В сетчатке поле, конечно, лаборатория Рэйчел Вонга в Университете Вашингтона. Там также много работы, люди сделали в других системах, например, гиппокамп подготовки срез. Мы не претендуем, чтобы иметь возможность дать полный обзор литературы, но проверить документы в списке ссылок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci STKE. 2000, (2000).
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).