Summary
En este artículo se demuestra que la disección y la incubación de la retina de un conejo y de partículas mediada por la transferencia de genes de plásmidos que codifican las buenas prácticas agrarias o de una variedad de marcadores subcelular en las células ganglionares de la retina.
Abstract
Sistemas funcionales organotípicos cultura de los tejidos neuronales son herramientas importantes en la investigación neurobiológica. Idealmente, este sistema debe ser compatible con técnicas de imagen, la manipulación genética, y el registro electrofisiológico. Aquí presentamos un tejido simple interfase sistema de cultivo de retina de un conejo adulto, que no requiere equipo especializado y muy poco mantenimiento. Nos demuestran que la disección y la incubación de retina de un conejo y de partículas mediada por la transferencia de genes de plásmidos que codifican las buenas prácticas agrarias o de una variedad de marcadores subcelular en células ganglionares de la retina. Retinas de conejo cultivadas de esta manera puede mantenerse vivo durante un máximo de 6 días con muy pocos cambios de la estructura anatómica general o la morfología de cada uno de ganglio y las células amacrinas.
Protocol
Hacer balas pistola de genes (GOLD)
- Hacer 100X PVP (0.5mg/ml) en EtOH al 100%.
- Pesar 30 mg de 1,6 micras de oro BioRad microportadores y colocarlo en un tubo eppendorf de 1,5 ml.
- Calcular la cantidad de plásmido necesarios para obtener una concentración de 0,5-3 g de oro plásmido / mg, y el lugar del plásmido en el tubo con la microportadores oro. Combine varios plásmidos, si es necesario.
- Aumentar el volumen de plásmido a 100 ml con agua destilada.
- Añadir 100 ml de 0,05 M espermidina en el tubo. Vortex tubo de 30 segundos.
- Vortex 1 minuto a máxima velocidad. Sonicar durante 3-5 minutos ..
- Seca una longitud adecuada de tubo de Tefzel en un aparato de PDS-1000/He Biorad durante 15 minutos.
- Después de la sonicación, vortex durante 1-2 minutos a máxima velocidad. Reduzca la velocidad lentamente para permitir que el tubo se abre mientras agitación.
- Añadir 100 ml de 1 M de CaCl2 lentamente a la caída de tubo de vórtice, mientras que sabia.
- Deje el tubo a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Haga Filtro de 5 micrones.
- Tome dos jeringas de 5 ml sin agujas.
- Retire el émbolo, y separar las tapas de color negro. Tomar pequeñas tijeras, cortar una parte de la tapa de negro para dar un anillo. Repetir en el otro buzo a la red dos anillos.
- Sandwich de un filtro de 5 micras (piezas pequeñas, Inc. nylon filtro, ½ pulgadas de diámetro) entre los dos anillos, y pulsar el bocadillo en la punta de la jeringa.
- Cuelgan de la jeringa sobre un frasco de 50 ml cónicos.
- Después de 10 minutos, agite el tubo durante 30 segundos.
- Centrifugar el tubo durante 30 segundos y guardar el precipitado.
- Añadir 1 ml de EtOH al 100% de pellet. Use punta de la pipeta para romper la pastilla, y agitar 30 segundos. Giro de 30 segundos y eliminar EtOH. Repita 2 veces más.
- Añadir 1 ml de EtOH al 100% de la pastilla (romper con la punta). Coloque esto en el filtro de 5 micras y dejar que fluya a través de la gravedad en el tubo de 50 ml cónicos. Un uso más EtOH como sea necesario para vaciar el tubo o la ayuda a través del flujo.
- Girar el tubo de 50 ml a 2000 rpm en la centrífuga durante 5-10 minutos. Extraer el sobrenadante, salvo pellet.
- Dependiendo de la densidad deseada de microportadores es necesario, agregue 1,5 ml 800μl-EtOH al 100% y el correspondiente 8 l-15 l solución de PVP.
- Remolino y acuda de inmediato a los aparatos PDS-1000/He Biorad.
- Biorad PDS-1000/He aparato
- Desconectar el tubo que conecta el tanque de gas N2 en el tubo de secado
- Sacar la tubería de secado de la máquina Tefzel
- Inserte un extremo en el tubo de 50 ml cónicos, y adjuntar una jeringa en el otro extremo de la tubería. Chupar pasta marrón en el centro del tubo.
- Inserte de nuevo el tubo en la máquina.
- Espera (sin rotación) durante 4 minutos
- Después de 4 minutos, chupar EtOH despacio y con cuidado, asegurándose de no molestar a microportadores.
- Gire el tubo durante 1 minuto.
- Después de 1 minuto, conectar el tubo que conecta la N 2 tanques de gas en el tubo de secado y que la tubería seca durante 15 minutos.
- Después de 15 minutos, cortar el tubo de tamaño de la viñeta a utilizar inmediatamente o almacenarse a 4 ° C en un desecador. Las balas se pueden almacenar hasta 3 meses.
Preparación de gen-gun
- Balas lugar en un cartucho. Cada pieza de la retina se puede disparar con balas de 1-3.
- Inserte el cartucho en el gen de la pistola y colocar el arma a una fuente de helio. Ajuste la presión de 110 psi.
Preparación de los medios de comunicación
- Disección medio
1 botella de solución de Ames (Sigma, 8,8 g) 1,9 g de bicarbonato de sodio 10 ml pluma 1% / estreptomicina / L-glutamina (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml de agua destilada a 1 litro ------------------------------- 1 Litro - Filtrar el medio de disección usando un filtro de 0,22 micras.
- Medio de incubación (500 ml)
485 ml de líquido de la disección de filtrado 5 ml de suplemento N2 1% (Gibco / Invitrogen) 10 ml de 1% de suero de caballo (Sigma) 500 l de rojo fenol -------------------------------------------------- - 0,5 L - Filtrar el medio de incubación utilizando un filtro de 0,22 micras.
- Burbuja de O 2 en el medio de la disección de 15 minutos antes de iniciar el protocolo de recolección de retina.
Preparación de las cámaras de incubación de la retina
- Bajo una campana, llenar varias placas de 60 mm de profundidad (cámaras de incubación, Nunc) con 25 ml de medio de incubación. El número de platos depende de la cantidad de retINAS necesario.
- Coloque un soporte de filtro en cada plato hondo. Sólo la punta de los que el soporte no debe ser sumergido.
- Coloque todos los platos hondos en la incubadora hasta que la retina esté listo.
- Llenar dos cajas de Petri de 100 mm y llevar a la mesa de disección.
Preparación de la retina de un conejo
- Sacrificar un conejo de acuerdo a los protocolos establecidos. Lo siguiente no tiene que llevarse a cabo bajo una campana.
- Con unas tijeras en ángulo, se inserta por detrás del ojo en la órbita del ojo del conejo, el corte de las membranas y el nervio óptico que se adjuntan a la vista.
- Levante suavemente el ojo y se lava con los medios de comunicación disección oxigenada.
- Lugar del ojo (córnea hacia arriba) en el pozo de una máquina de cortar los ojos y cerrar la tapa.
- Coloque la cuchilla horizontalmente a la derecha debajo de la tapa. En un movimiento suave, dibuja la hoja a través del ojo de cortar la córnea, dejando un ocular.
- Con unas pinzas, retire la retina de la máquina de cortar los ojos bien y colocarlo en un papel de filtro.
- Extraer el humor vítreo y el cristalino por la unión de un área cercana al nervio seccionado óptico y tirando hacia atrás en un papel de filtro. Repita varias veces hasta que casi todo el vítreo se quita y la copa del ocular se ve desinflado.
- Coloque un ocular en una placa Petri con medios de disección para lavar.
- Cortar la copa del ocular en el número deseado de unidades (un máximo de 5 piezas).
- Tome un pedazo de taza del ojo y colocarlo bajo el microscopio.
- Abrazadera de la esclerótica y la coroides ligera junto a la orilla de la retina con el fórceps. Con la otra mano, use un cepillo fino para cepillo adecuado entre la coroides y retina.
- Con movimientos cortos y suaves, se burlan de la retina de la coroides hasta que se desprende.
- Corte a 1 pulgada de una pipeta de transferencia estéril. Utilice esta opción para aspirar a la retina y el lugar en una placa Petri de medio de incubación de lavar.
- Utilizando otra pipeta de transferencia estéril con 1 pulgada de cortar, con cuidado de transferencia de la retina en un 0,4 micras Millicell filtro (Millipore, Cat No: PICMORG50).
- Use un cepillo para orientar la retina con el lado de las células ganglionares hacia arriba.
- Aplanar la retina con el cepillo ligeramente en los bordes de la retina. Minimice el contacto de la capa de células ganglionares con el pincel lo más posible.
- Retire el exceso de medio de filtro con una pipeta de transferencia.
- Con unas pinzas, transferir el filtro a un suctioner modificado. Dibuje en la suctioner 2.3 veces para eliminar todo el medio de incubación del filtro.
Gene disparando y la incubación de la retina
- Bajo una campana, cada lugar de la retina que contiene los filtros en las gradas del filtro en la placas de 60 mm de profundidad (cámaras de incubación).
- Asegúrese de que el medio está en contacto con la parte inferior del filtro y que el medio no se derrame por los lados del filtro en la retina. El filtro debe actuar como interfaz entre la retina y medianas empresas.
- Dispara a cada pieza de la retina con dos balas. Coloque la pistola de genes directamente sobre los tejidos, unos 3-4 cm de distancia.
- Coloque todas las cámaras de incubación en un agitador en el 35 - 37 ° C incubadora.
- Sustituir por medio de incubación todos los días. La retina puede ser incubados durante un máximo de 6 días.
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Discussion
1. ¿Qué puedo hacer con este método?
- Ver claramente la morfología celular.
- Las células de la etiqueta de registro de los mismos.
- Sobreexpresan proteínas, como PSD95, sino también de otras proteínas que modulan la respuesta de la célula, por ejemplo, canales iónicos, receptores.
- Expresar RNAs inhibidores.
2. ¿Cuánto tiempo puedo mantener retina adulta?
- Cuatro días no es problema para conejo adulto. Seis días después, las células se ven "mal", es decir, retirar los axones, usted ve hinchazón de las dendritas y el registro de las respuestas de la luz se convierte en poco fiables (sólo ~ 50% de las células resultaron ser sensibles a la luz después de ese tiempo.
- Seguimos ratón retinas durante 2 días. Los ratones son más difíciles, debido a que la retina se vascularizada, y también más gruesa que la retina del conejo.
3. ¿Cómo asegurarse de que su retina está sana después de este tiempo?
- El patrón oro es la grabación de los mismos. Las células ganglionares aún debe reaccionar a la luz. Se debe proteger el tejido de la luz durante la incubación para evitar el blanqueo de la fotopigmento, ya que hay que diseccionar la retina y la desprende del epitelio pigmentario de la incubación.
- En ocasiones también se utiliza la grabación de microelectrodos conjunto para poner a prueba nuestras retinas.
4. ¿Por qué quieren manipular a sólo unas pocas células de la retina a la vez?
- Algunas de las preguntas no se pueden abordar de otra manera. Considérese, por ejemplo, los receptores de GABA en las células ganglionares. Usted podría utilizar los bloqueadores de GABA, pero que podría inhibir la transmisión de todos GABAérgicas en la retina, y no sólo la entrada a la celda en la que están interesados ya que ésta puede ser muy difícil distinguir entre un efecto en esa celda en particular, y en general "efectos de red "en toda la retina.
- Si quieres ver la morfología claramente, no se puede etiquetar todas las células, de lo contrario, acaba de obtener un lío.
5. ¿Es este método adecuado como una población mancha?
- Gunning No. génica es un procedimiento aleatorio. Usted obtendrá muchas células ganglionares, muchas células amacrinas desplazadas, algunas células de Müller, y mucho menos de todos los otros tipos de células.
6. ¿Hay algún "trucos" que tengo que saber para hacer que funcione?
- En realidad no. Pero es importante que lo haga la disección de la retina con relativa rapidez, por lo que tiene sus piezas en el filtro en menos de 30 minutos. Las piezas no deben ser demasiado pequeño, alrededor de un centímetro cuadrado está bien. Espere 3-4 piezas de un ojo del conejo.
- Mantener sus herramientas de disección estrictamente de cualquier cosa que entra en contacto con fijadores y otros productos químicos.
- Prueba a poner su incubadora a 35 ° C en lugar de 37, por lo que la retina no se pone demasiado caliente.
- No es necesario añadir los factores de crecimiento como el BDNF en su medio, al menos no lo hacen de manera rutinaria, pero debe usar suplemento N2, 1% de suero de caballo, y los antibióticos. Ofrecemos una lista de todas las cosas que usted y que necesitará como un archivo adicional a esta documentación.
7. ¿Podría gen-gun otras cosas, en lugar de los plásmidos?
- Sí, se han utilizado tintes conjugados dextranos o DII y Dio. Pero se puede usar el indicador de calcio colorantes, o casi cualquier cosa que usted puede cubrir en balas de oro o de tungsteno.
8. ¿Cuáles son las limitaciones?
- En primer lugar, el tiempo. Usted tiene que cortar el nervio óptico, lo que significa que las células ganglionares de la larga se degeneran. Esto no es un problema para un máximo de 6 días, pero después de que no confiaría en las retinas más. Ahora, si lo que desea expresar GFP o algún otro marcador de células de relleno, de una incubación de 2-3 días es suficiente, pero en algunos casos, como cuando se quiere expresar RNAs inhibidores, el efecto puede tardar de 4 o más días a la show. En este caso, usted tiene que mantener la línea de tiempo en la mente.
9. ¿Qué trabajo otro investigador debería ser consciente de uno?
- En el campo de la retina, sin duda laboratorio Rachel Wong en la Universidad de Washington. También hay un montón de trabajo la gente ha hecho en otros sistemas, como la preparación de hipocampo rebanada. No pretendemos ser capaces de presentar un estudio completo de la literatura, pero echa un vistazo a los papeles en la lista de referencias.
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