Summary
Denna artikel visar dissekering och inkubering av kanin näthinna och partikel-medierad genöverföring av plasmider kodning GFP eller en variation av subcellulära markörer i retinal ganglion celler.
Abstract
Organotypic kultur system av funktionella neuronala vävnader är viktiga verktyg i neurobiologisk forskning. Helst bör ett sådant system är förenligt med avbildningstekniker, genetisk manipulation, och elektrofysiologiska inspelning. Här presenterar vi ett enkelt interfas systemet vävnadsodling för vuxna kanin näthinna som inte kräver någon särskild utrustning och mycket lite underhåll. Vi visar de dissekering och inkubering av kanin näthinna och partikel-medierad genöverföring av plasmider kodning GFP eller en variation av subcellulära markörer i retinal ganglion celler. Kanin näthinnor odlade på detta sätt kan hållas vid liv i upp till 6 dagar med mycket små förändringar i den övergripande anatomiska struktur eller morfologi av enskilda ganglion-och amakrina celler.
Protocol
Göra gen pistol kulor (GOLD)
- Gör 100X PVP (0.5mg/ml) i 100% EtOH.
- Väg upp 30 mg BioRad 1,6 Micron microcarrier guld och placera den i ett 1,5 ml Eppendorf-rör.
- Beräkna plasmiden behövs för att ge en koncentration av 0,5-3 mikrogram plasmid / mg guld, och placera plasmid i röret med guld microcarriers. Kombinera flera plasmider om det behövs.
- Ta volym av plasmid till 100 l med destillerat vatten.
- Tillsätt 100 ìl 0,05 spermidine i röret. Vortexröret 30 sekunder.
- Vortex 1 minut vid full hastighet. Sonikera 3-5 minuter ..
- Torka en lämplig längd Tefzel slang i en Biorad PDS-1000/He apparater för 15 minuter.
- Efter ultraljudsbehandling, virvel i 1-2 minuter på full fart. Minska hastigheten långsamt så att röret kan öppnas samtidigt vortexa.
- Tillsätt 100 l 1 M CaCl 2 långsamt till röret droppvis medan vortexa.
- Lämna röret i rumstemperatur i 10 minuter.
- Gör 5 Micron filter.
- Ta två 5ml sprutor utan nålar.
- Ta ut kolven, och ta bort den svarta mössor. Med en liten sax, skära av en del av det svarta locket för att ge en ring. Upprepa på andra kolven till netto två ringar.
- Sandwich ett 5 mikron (små delar, Inc. nylon filter, ½ tums diameter) filter mellan två ringar, och tryck smörgås i spetsen av sprutan.
- Dingla spruta över en 50 ml E-kolv.
- Efter 10 minuter, virvel röret i 30 sekunder.
- Centrifugera röret i 30 sekunder och spara pelleten.
- Tillsätt 1 ml 100% EtOH till pellets. Använd Pipettspetsen att bryta upp pelleten och Vortex 30 sekunder. Spin 30 sekunder och ta bort EtOH. Upprepa två gånger till.
- Tillsätt 1 ml 100% EtOH till pellet (slut med tips). Placera in de 5 Micron filtret och låta det flöda genom självfall fram till 50 ml koniska rör. Använd mer EtOH som behövs för att skölja ur röret eller hjälp med flödet genom.
- Snurra 50ml röret vid 2000rpm i centrifug i 5-10 minuter. Avlägsna supernatanten, spara pelleten.
- Beroende på önskad densitet som behövs microcarriers, lägga 800μl-1,5 ml 100% EtOH och motsvarande 8 l-15 l PVP lösning.
- Snurra och omedelbart gå till Biorad PDS-1000/He apparaten.
- Biorad PDS-1000/He apparater
- Koppla röret som förbinder tanken N2 gas till torkning röret
- Ta ut torkning Tefzel slangen från maskinen
- Sätt in ena änden i 50 ml koniska rör, och koppla en spruta till den andra änden av slangen. Suck brunt slam i mitten av röret.
- Sätt slangen tillbaka in i maskinen.
- Vänta (utan rotation) i 4 minuter
- Efter 4 minuter, suga bort EtOH långsamt och försiktigt, och se till att inte störa microcarriers.
- Vrid slangen i 1 minut.
- Efter 1 minut, anslut röret som förbinder N 2 bensintanken till torkning röret och låt slangen torka i 15 minuter.
- Efter 15 minuter, skär slangen till kulan storlek skall användas omedelbart eller lagras vid 4 ° C i en exsiccator. Kulor kan lagras upp till 3 månader.
Beredning av gen-gun
- Placera kulor i en kassett. Varje del av näthinnan kan skjutas med 1-3 kulor.
- Sätt in kassetten i gen-gun och fäst pistol mot en helium källa. Ställ in trycket till 110 Psi.
Beredning av medier
- Dissection medelstora
1 flaska Ames lösning (Sigma, 8.8g) 1,9 GM natriumbikarbonat 10 ml 1% penna / STREP / L-glutamin (1:100) (Gibco / Invitrogen) 990 ml destillerat vatten till 1L ------------------------------- 1 Liter - Filtrera dissektion mediet med hjälp av ett 0,22 ìm filter.
- Inkubation medium (500ml)
485 ml filtrerat dissektion medier 5 ml 1% N2 tillägg (Gibco / Invitrogen) 10ml 1% häst serum (Sigma) 500 ìl fenolrött -------------------------------------------------- - 0,5 L - Filtrera inkubation mediet med hjälp av ett 0,22 ìm filter.
- Bubble O 2 i dissektion medium för 15 minuter innan protokollet näthinnan skörd.
Beredning av inkubation kammare för näthinnan
- Enligt en huva, fylla flera 60 mm djup rätter (inkubation kammare, Nunc) med 25 ml inkubation medium. Antalet rätter beror på antalet av RETInas behövs.
- Placera ett filter står i varje djup skål. Endast de allra tips på stativet bör inte vara under vatten.
- Placera alla djupa rätter i inkubatorn tills näthinnor är redo.
- Fyll två 100 mm petriskålar och ta med till dissekering bänken.
Beredning av kanin näthinna
- Offra en kanin i enlighet med fastställda protokoll. Följande behöver inte utföras under en huva.
- Med vinklad sax, sätter den bakom ögat i ögonhålan av kanin, klippa membran och optiska nerv som är knutna till ögat.
- Lyft försiktigt ut ögat och tvätta den med syresatt dissektion medier.
- Placera ögat (hornhinnan uppåt) i brunnen av ett öga slicer och stäng locket.
- Placera bladet horisontellt precis under locket. I en jämn rörelse, dra kniven på ögat för att skära av hornhinnan och lämnar ett öga kopp.
- Använd pincett, ta bort näthinnan från ögat slicer väl och lägg den på ett filtrerpapper.
- Ta bort glaskropp och lins genom att spänna fast ett område nära avhuggna synnerven och dra bakåt på ett filtrerpapper. Upprepa flera gånger tills nästan hela glaskroppen tas bort och ögat koppen ser deflateras.
- Placera ögonmussla i en petriskål med dissektion media att tvätta.
- Skär ögonmussla i önskat antal bitar (5 st max).
- Ta en bit av ögat kopp och placera den under mikroskop.
- Kläm fast sklera och åderhinnan lätt ihop på kanten av näthinnan med hjälp av tång. Med den andra handen, använda en fin pensel för att borsta rätt mellan åderhinnan och näthinnan.
- Med korta, mjuka rörelser, retas näthinnan från åderhinnan tills det lossnar.
- Klipp 1 cm av en steril överföringspipett. Använd detta för att suga upp näthinnan och placera i en petriskål av inkubationen medel att tvätta.
- Använda en annan steril överföringspipett med 1 tum avskurna, töm näthinnan på en 0,4 ìm Millicell filter (Millipore, Cat nr: PICMORG50).
- Använd en borste för att orientera näthinnan med gangliecell uppåt.
- Platta ut näthinnan genom att borsta lätt på kanterna på näthinnan. Minimera röra lagret gangliecell med penseln så mycket som möjligt.
- Ta bort överflödig medium på filter med en överföringspipett.
- Använd pincett, överföring filtret på en modifierad suctioner. Rita på suctioner 2-3 gånger för att ta bort alla inkubationen mediet från filtret.
Gene Gunning och inkubation av näthinnan
- Enligt en huva, placera varje av näthinnan som innehåller-filter på filtret står i 60 mm djup rätter (inkubation kammare).
- Kontrollera att mediet är i kontakt med undersidan av filtret och att mediet inte spiller över sidorna av filtret på näthinnan. Filtret bör fungera som ett gränssnitt mellan näthinnan och medium.
- Skjut varje del av näthinnan med två kulor. Placera gen pistol rakt ovanför vävnaden, ca 3-4 cm avstånd.
- Placera alla inkubation kammare på en shaker i 35 - 37 ° C inkubator.
- Ersätt med inkubering medel varje dag. Näthinnan kan inkuberas i högst 6 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Vad kan jag göra med den här metoden?
- Se cellmorfologin tydligt.
- Label celler för att spela in från dem.
- Överuttrycker proteiner, som PSD95, men även andra proteiner som modulera cellens svar, t.ex. jonkanaler, receptorer.
- Express hämmande RNA.
2. Hur länge kan jag hålla vuxen näthinnan?
- 4 dagar är inget problem för vuxna kaniner. Efter sex dagar i cellerna ser "sjuka", dvs axoner tillbaka, ser du svullnad av dendriter och registrering av lätta svar blir otillförlitlig (bara ~ 50% av cellerna befanns vara ljus-känslig efter denna tidpunkt.
- Vi höll musen näthinnor i 2 dagar. Möss är svårare, eftersom näthinnor är vaskulariserad och även tjockare än kanin näthinnan.
3. Hur gör jag säker på näthinnan är frisk efter denna tid?
- Guldmyntfoten spelar in från dem. Ganglion celler ska fortfarande reagerar på ljus. Du ska skydda din vävnad från ljus under inkubationen att undvika blekning av photopigment, eftersom du måste dissekera näthinnan från pigmentepitel för inkubering.
- Vi ibland också används inspelning mikroelektrod array för att testa våra näthinnor.
4. Varför vill du att manipulera ett fåtal celler i näthinnan på en gång?
- Vissa frågor kan inte lösas på annat sätt. Tänk till exempel GABA-receptorer på ett ganglion cell. Du kan använda GABA-blockerare, men du skulle hämma alla GABAergic överföring i näthinnan, inte bara ingången till den cell du är intresserad Det kan vara mycket svårt att skilja mellan en effekt på cellen i synnerhet, och övergripande "nätverkseffekter "på det hela näthinnan.
- Om du vill se morfologi klart, kan du inte märka alla celler, annars får du bara en enda röra.
5. Är denna metod lämpar sig som en population fläck?
- Nej Gene Gunning är ett slumpmässigt förfarande. Du får många ganglion celler, många fördrivna amakrina celler, vissa Muller celler, och mycket mindre av alla andra celltyper.
6. Finns det några "knep" jag måste veta för att få det att fungera?
- Inte riktigt. Men det är viktigt att du gör dissektion av näthinnan relativt snabbt, så du har dina pjäser på filtret på mindre än 30 minuter. Bitarna bör inte vara för liten, ungefär en kvadratcentimeter är ok. Räkna med 3-4 bitar från en kaninöga.
- Håll din dissektion verktyg strikt borta från allt som kommer i kontakt med fixativ och andra starka kemikalier.
- Försök att ställa din kuvös till 35 C i stället för 37, så näthinnan aldrig blir för varm.
- Du behöver inte lägga till tillväxtfaktorer som BDNF till ditt medium, åtminstone vi inte gör det rutinmässigt, men du bör använda N2 komplettera, 1% häst serum och antibiotika. Vi tillhandahåller en lista över alla de saker du och kommer att behöva som en kompletterande fil till denna dokumentation.
7. Skulle du kunna gen-gun andra saker, snarare än plasmider?
- Ja, vi har använt dye-konjugerade dextraner eller DII och DIO. Men du kan använda kalcium-indikator färgämnen, eller i stort sett allt du kan pälsen på guld eller wolfram kulor.
8. Vilka är begränsningarna?
- Först av allt, tid. Du måste klippa av synnerven, vilket innebär att ganglion celler så småningom kommer att urarta. Detta är inte ett problem för upp till 6 dagar, men efter att vi inte skulle lita på näthinnor längre. Nu, om du bara vill uttrycka GFP eller någon annan cell som fyller markör, är en inkubationstid på 2-3 dagar räcker, men i vissa fall, som när man vill uttrycka hämmande RNA kan effekten ta 4 eller fler dagar till show. Här måste du hålla tidslinjen i åtanke.
9. Vilka andra forskares arbete bör man vara medveten om?
- I näthinnan område, verkligen Rachel Wong labb vid Washington University. Det finns också en hel del arbete människor har gjort i andra system, såsom hippocampus skiva beredning. Vi låtsas inte att kunna ge en fullständig genomgång av litteraturen, men kolla in tidningarna i referenserna lista.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci STKE. 2000, (2000).
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
