Summary
Bu makale, tavşan retina ve parçacık GFP veya retina ganglion hücrelerinin içine Subselüler belirteçleri çeşitli kodlama plazmid aracılı gen transferi diseksiyonu ve inkübasyon göstermektedir.
Abstract
Fonksiyonel sinir dokularının Organotipik kültür sistemleri nörobiyolojik araştırma önemli araçlardır. İdeal olarak, böyle bir sistemin görüntüleme teknikleri, genetik manipülasyon ve elektrofizyolojik kayıt ile uyumlu olmalıdır. Burada hiçbir özel ekipman ve çok az bakım gerektirir yetişkin tavşan retina için basit bir interfaz doku kültürü sistemi mevcut. Biz tavşan retina ve parçacık GFP veya retina ganglion hücrelerinin içine Subselüler belirteçleri çeşitli kodlama plazmid aracılı gen transferi diseksiyon ve inkübasyon göstermektedir. Tavşan retina, bu şekilde genel anatomik yapısı çok az değişiklik ya da bireysel morfolojisi ganglion ve amacrine hücreleri ile 6 gün kadar canlı tutulabilir kültür.
Protocol
Yapma gen tabancası mermi (GOLD)
- 100X PVP (0.5mg/ml) 100% EtOH olun.
- BioRad 1.6 Mikron microcarrier altın, 30 mg tartılır ve 1.5 ml Eppendorf tüp içine yerleştirin.
- 0.5-3 mg / mg plazmid altın bir konsantrasyon vermek için gerekli plazmid miktarını hesaplayın ve altın microcarriers ile plazmid tüpün içine yerleştirin. Gerekirse birkaç plazmid birleştirin.
- Distile su ile 100 ul plazmid hacim kazandırın.
- Tüpe 100 ul 0.05M spermidin ekleyin. Vorteks tüp 30 saniye.
- Vortex tam hızda 1 dakika. 3-5 dakika sonikasyon ..
- 15 dakika boyunca Biorad PDS-1000/He aparat Tefzel boru uzunluğu uygun bir kurulayın.
- Sonication sonra, tam hızda 1-2 dakika karıştırın. Vorteks sırasında tüp açılacak izin yavaş yavaş hız azaltın.
- Vorteks ise tüp damlasına kadar bilge, 1 M CaCl yavaş yavaş 2 100 ul ekleyin .
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında tüp bırakın.
- 5 mikron filtre olun.
- Iki 5ml iğnesiz şırınga alın.
- Piston çıkarın ve siyah kapaklar ayırmak. Küçük bir makas alarak, bir halka vermek için siyah kapak bir parçası kesti. Net iki yüzük diğer piston tekrarlayın.
- Sandviç 5 mikron (Küçük Parça, Inc naylon filtre, ½ inç çapında) iki halkaları arasında, filtre, sandviç ve şırınga ucu içine itin.
- 50ml erlene üzerinde Dangle şırınga.
- 10 dakika sonra, 30 saniye boyunca tüp vorteks.
- 30 saniye boyunca tüp Santrifüj ve pelet kaydetmek.
- Pelet 100% EtOH 1 ml ekleyin. Pelet ve vorteks 30 saniye kadar kırmak için pipet kullanın. 30 saniye Spin ve EtOH kaldırmak. 2 kez daha tekrarlayın.
- (Ucu ile break up) pelet% 100 EtOH 1 ml ekleyin. 5 mikron filtre içine koyun ve 50 ml konik tüp içine yerçekimi ile akış sağlar. Tüp yıkayın veya akış yardımcı gerektiği gibi EtOH kullanın.
- 5-10 dakika santrifüj 2000rpm 50ml tüp dönerler. Süpernatant, kaydetmek pelet çıkarın.
- 800μl-1.5ml% 100 EtOH ve buna karşılık gelen 8 ul-15 ul PVP çözümü eklemek için, gerekli microcarriers istenen yoğunluğuna bağlı.
- Swirl ve Biorad PDS-1000/He aparat hemen gidin.
- Biorad PDS-1000/He aparat
- Kuruma tüp N2 gaz tankı bağlayan tüp çıkarın
- Tefzel boru kurutma makineden çıkarın
- 50ml konik tüp içine bir ucunu, bir şırınga ve hortumun diğer ucuna takın. Tüpün ortasında kahverengi bir bulamaç Suck.
- Makinenin içine tüp geri takın.
- 4 dakika bekleyin (rotasyon)
- 4 dakika sonra, microcarriers rahatsız değil emin olun, yavaş ve dikkatli EtOH emmek.
- Tüp 1 dakika çevirin.
- 1 dakika sonra, N 2 gaz tankı bağlayan tüp kurutma tüpüne bağlamak ve 15 dakika boyunca tüp kurumaya bırakın.
- 15 dakika sonra, bir exsiccator 4 ° C'de hemen veya depolanmış olması bullet boyutu boru kesti. Bullets 3 ay kadar saklanabilir.
Gen tabancasının hazırlanması
- Bir kartuş içine yerleştirin mermi. Retinanın her parçası 1-3 mermi ile çekilebilir.
- Gen tabancası kartuşu takın ve helyum kaynağı silah takın. Basınç 110 Psi ayarlayın.
Ortam hazırlanması
- Diseksiyon orta
1 şişe Ames solüsyonu (Sigma, 8.8g) 1.9 gram sodyum bikarbonat -Glutamine (1:100) (Gibco / Invitrogen 10 ml% 1 pen / strep / L) 990 ml distile su 1L ------------------------------- 1 Litre - 0.22 mikron filtre kullanılarak diseksiyon orta Filtre.
- Kuluçka orta (500ml)
485 ml süzülmüş diseksiyonu medya 5 ml% 1 N2 takviyesi (Gibco / Invitrogen) 10ml% 1 at serumu (Sigma) 500 ul fenol kırmızısı -------------------------------------------------- - 0,5 L - 0.22 mikron filtre kullanarak kuluçka orta Filtresi.
- Bubble O 2 retina hasat protokolü başlamadan önce 15 dakika boyunca diseksiyon ortama.
Retina inkübasyon odaları hazırlanması
- Kaputun altında, 25 ml inkübasyon orta birkaç 60 mm derin yemekleri (kuluçka odaları, Nunc) doldurun. Yemeklerin sayısı ret sayısı bağlıdır.Inas gerekli.
- Her bir filtre stand derin bir çanak içine yerleştirin. Stand Sadece çok ipucu batık olmamalıdır.
- Retinanın hazır olana kadar tüm derin yemekleri inkübatör içine yerleştirin.
- Iki adet 100 mm petri kaplarına doldurun ve diseksiyon tezgah getirmek.
Tavşan retina hazırlanması
- Prosedürlere göre bir tavşan Kurban. Aşağıda bir başlık altında yapılacak bulunmamış.
- Açılı makas, gözü bağlı membranlar ve optik sinir kesme, tavşan gözü sokete gözün arkasına yerleştirin.
- Göz yavaşça kaldırın ve oksijenli diseksiyon medya ile yıkayın.
- Göz (kornea yukarı bakacak şekilde) bir göz dilimleyiciyi kuyunun içine yerleştirin ve kapağını kapatın.
- Kapağı altında yatay bıçak yerleştirin. Tek bir düzgün hareket, bir göz fincan bırakarak, gözün kornea kesmek boyunca bıçak çizin.
- Forseps kullanarak, gözün dilimleyiciyi retina kaldırmak ve bir filtre kağıdının üzerine yerleştirin.
- Vitreus ve lens kopmuş optik sinir yakınındaki bir alanda sıkma ve bir filtre kağıdı üzerinde geriye doğru çekerek çıkartın. Hemen hemen tüm vitreus kaldırılır ve göz fincan deflate görünene kadar birkaç kez tekrarlayın.
- Göz bardak yıkamak için diseksiyon medya ile bir petri kaplarına yerleştirin.
- Adet istenilen sayıda (en fazla 5 adet) içine göz fincan kesin.
- Göz fincan tek parça alın ve mikroskop altında yerleştirin.
- Forseps kullanarak retinanın kenarına hafifçe birlikte sklera ve koroid Kelepçe. Diğer elinizle, sağ koroid ve retina arasında ince bir fırça fırça kullanın.
- Müstakil hale gelinceye kadar kullanarak, kısa ve nazik hareketlerle kapalı retina koroid kızdırmak.
- 1 inç, steril bir transfer pipet kapalı kesin. Inkübasyon orta yıkamak için bir petri içine retina ve emmek için bunu kullanın.
- 1 inç ile başka bir steril transfer pipet kullanarak 0,4 mikron Millicell filtresi (: PICMORG50 Millipore, Kedi No) üzerine retina transfer dikkatlice kesti.
- Ganglion hücre yüzü yukarı bakacak şekilde retina yönlendirmek için bir fırça kullanın.
- Retinanın retina kenarlarını hafifçe fırçalama düzleştirin. Ganglion hücre tabakası fırça ile mümkün olduğunca dokunmadan en aza indirin.
- Bir transfer pipet yardımıyla filtre fazla orta çıkarın.
- Forseps kullanarak, değiştirilmiş bir suctioner üzerine filtre transfer. Suctioner filtre tüm inkübasyon ortamı kaldırmak için 2-3 kez çizin.
Gen gunning ve retinanın inkübasyon
- Bir başlık altında, 60 mm derinliğinde yemekler (kuluçka odaları), filtre standları üzerine retina içeren filtreleri her yerde.
- Orta, alt filtre ile temas ve orta retina üzerine filtre taraf üzerinde dökmeyin olduğundan emin olun. Bu filtre, retina ve orta arasında bir arayüz olarak hareket etmelidir.
- Retinanın her parça iki mermi ile vur. Doğrudan doku üstünde yeri gen tabancası, yaklaşık 3-4 cm uzakta.
- 35 - 37 ° C inkübatör bir çalkalayıcı üzerine tüm kuluçka odalarına yerleştirin.
- Inkübasyon ortamı her gün değiştirin. Retinanın en fazla 6 gün inkübe edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Bu yöntem ile ne yapabilirim?
- Hücre morfolojisi açıkça bakın.
- Bunları kaydetmek için Etiket hücreleri.
- Eksprese PSD95 gibi proteinler, ama aynı zamanda hücre yanıtı modüle diğer proteinlerin, örneğin iyon kanalları, reseptörler.
- Hızlı inhibitör RNA'lar.
2. Ne kadar süre yetişkin retina tutabilir mi?
- 4 gün yetişkin tavşan için hiç sorun değil. Altı gün sonra hücreler "hasta" bakmak, yani aksonlar geri çekmek, güvenilmez hale geldi dendritler şişlik ve hafif yanıtların kayıt (sadece ~ bu saatten sonra ışığa duyarlı hücrelerin% 50 bulundu.
- , 2 gün boyunca fare retina devam etti. Retinanın tavşan retinanın daha kalın vaskülarize, çünkü fareler, daha zordur.
3. Bu süre sonra retinanın sağlıklı olduğundan emin nasıl yapabilirim?
- Altın standart kayıt. Ganglion hücrelerinin ışığa tepki vermeleri gerekmektedir. Inkübasyon için kapalı retina pigment epitel incelemek gerekir, çünkü, photopigment beyazlatma önlemek için inkübasyon sırasında ışıktan doku korumak gerekir.
- Bazen de bizim retina mikroelektrot dizi test etmek için kayıt kullanılır.
4. Neden, bir defada retinada sadece birkaç hücre işlemek için istiyorsun?
- Bazı sorular başka türlü ele alınamaz. Örneğin GABA reseptörlerine ganglion hücre düşünün. GABA blokerler, ama özellikle bu hücre üzerinde bir etkisi ayırt etmek çok zor, ve genel olarak "ağ etkileri olabilir inç ilginizi hücreye sadece giriş, retinanın tüm GABAerjik iletim inhibe olur "tüm retina üzerinde.
- Morfoloji açıkça görmek istiyorsanız, tüm hücreleri etiket olamaz, aksi takdirde sadece bir karmaşa.
5. Bu yöntem, bir nüfus leke olarak uygun mudur?
- No Gen gunning rastgele bir işlemdir. Ganglion hücrelerinin birçok yerinden amacrine hücreleri, bazı Müller hücreleri ve diğer hücre türleri daha az alacaksınız.
6. , Çalışması için bilmek zorunda herhangi bir "püf noktası" var mı?
- Aslında değil. Ama nispeten hızlı bir şekilde retinanın diseksiyonu önemlidir, bu yüzden, en az 30 dakika içinde filtre adet var. Parçaları bir santimetrekare ok hakkında, çok küçük olmamalıdır. Bir tavşan gözü 3-4 adet bekliyoruz.
- Diseksiyon araçları fiksatif ve diğer sert kimyasallar ile temas şey kesinlikle uzakta tutun.
- Inkübatör ayar yerine 37 den 35 C deneyin, retinanın çok sıcak geçmez.
- En azından biz rutin olarak bunu yapmayın, BDNF gibi orta büyüme faktörleri eklemek gerek yok, ama N2,% 1 ek at serumu ve antibiyotik kullanmak gerekir. & 'Bu belgelere ek bir dosya olarak ihtiyacınız olacak tüm şeylerin bir listesini sağlar.
7. Gen-gun başka şeyler yerine, plazmid misiniz?
- Evet, boya-konjuge dextrans veya DII ve Dio kullanılır. Ama kalsiyum göstergesi boyalar, ya da altın veya tungsten mermi üzerine kat oldukça çok şey olabilir.
8. Sınırlamaları nelerdir?
- Her şeyden önce, zaman. Ganglion hücrelerinin sonunda dejenere olacağını anlamına gelen optik sinir, kesmek zorunda. Bu 6 gün için bir sorun değildir, ama bundan sonra biz bir daha retina güven olmaz. Şimdi, sadece, GFP veya ifade etmek istiyorsanız, diğer bazı hücre doldurma işaretleyici, 2-3 günlük bir inkübasyon yeterlidir, ancak bazı durumlarda, inhibitör RNA'lar ifade etmek istediğiniz zaman olduğu gibi, bu etki 4 gün veya daha uzun sürebilir göstermektedir. Burada, zaman çizelgesi aklınızda tutmak zorunda.
9 - Ne diğer araştırmacı çalışmaları bir farkında olmalıdır?
- Retina alanında, kesinlikle, Washington Üniversitesi'nde Rachel Wong'un laboratuvar. Insanlar hipokampus dilim hazırlama gibi diğer sistemleri, yapılan pek çok çalışma da bulunuyor. Biz literatürde tam bir anket vermek mümkün gibi, ancak referanslar listesinde kağıtları kontrol yok.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Landreth,, Agranoff, B. W. Explant culture of adult goldfish retina: a model for the study of CNS regeneration. Brain Res. 161, 39-55 (1979).
- Smalheiser, N. R., Crain, S. M., Bornstein, M. B. Development of ganglion cells and their axons in organized cultures of fetal mouse retinal explants. Brain Res. 204, 159-178 (1981).
- Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, 27-39 (1982).
- Rehm, H., Schafer, T., Betz, H. Beta-bungarotoxin-induced cell-death of neurons in chick retina. Brain Res. 250, 309-319 (1982).
- Kim, S. U., Takahashi, H. Tissue culture study of adult human retina neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 29, 1372-1379 (1988).
- Caffe, A. R., Soderpalm, A., van Veen, T. Photoreceptor-specific protein expression of mouse retina in organ culture and retardation of rd degeneration in vitro by a combination of basic fibroblast and nerve growth factors. Curr Eye Res. 12, 719-726 (1993).
- Wong, H. C., Thompson, S., Yu, D. Y., Cringle, S. J., Alder, V. A., Taylor, S. J. Comparison of growth rates of bovine retinal and brain microvascular pericytes in different oxygen concentrations in vitro. Aust N Z J Ophthalmol. 23, 299-308 (1995).
- Seigel, G. M. The golden age of retinal cell culture. Mol Vis. 5, 4 (1999).
- Caffe, A. R., Ahuja, P., Holmqvist, B., Azadi, S., Forsell, J., Holmqvist, I., et al. Mouse retina explants after long-term culture in serum free medium. J Chem Neuroanat. 22, 263-273 (2001).
- Hatakeyama, J., Kageyama, R. Retrovirus-mediated gene transfer to retinal explants. Methods. 28, 387-395 (2002).
- Zhang, S. S., Fu, X. Y., Barnstable, C. J. issue culture studies of retinal development. Methods. 28, 439-447 (2002).
- Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
- Inoue, T., Hojo, M., Bessho, Y., Tano, Y., Lee, J., Kageyama, R. Math3 and NeuroD regulate amacrine cell fate specification in the retina. Development. 129, 831-842 (2002).
- Kretz, A., Hermening , S. H., Isenmann , S. A novel primary culture technique for adult retina allows for evaluation of CNS axon regeneration in rodents. J Neurosci Methods. 136, 207-219 (2004).
- Liljekvist-Larsson, I., Johansson, K. Retinal neurospheres prepared as tissue for transplantation. Brain Res Dev Brain Res. 160, 194-202 (2005).
- Reidel, B., Orisme, W., Goldmann, T., Smith, W. C., Wolfrum, U. Photoreceptor vitality in organotypic cultures of mature vertebrate retinas validated by light-dependent molecular movements. Vision Res. 46, 4464-4471 (2006).
- Xin, H., Yannazzo, J. A., Duncan, R. S., Gregg, E. V., Singh, M., Koulen, P. A novel organotypic culture model of the postnatal mouse retina allows the study of glutamate-mediated excitotoxicity. J Neurosci Methods. 159, 35-42 (2007).
- Johnston, S. A., Tang, D. C. The use of microparticle injection to introduce genes into animal cells in vitro and in vivo. Genet Eng (N Y). 15, 225-236 (1993).
- Lo, D. C., McAllister, A. K., LC, K. atz Neuronal transfection in brain slices using particle-mediated gene transfer. Neuron. 13, 1263-1268 (1994).
- Rajagopalan, L. E., Malter, J. S. Turnover and translation of in vitro synthesized messenger RNAs in transfected, normal cells. J Biol Chem. 271, 19871-19876 (1996).
- McAllister, A. K. Biolistic transfection of neurons. Sci STKE. 2000, (2000).
- Gan, W. -B., Grutzendler, J., Wong, W., Wong, R., Lichtman, J. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Sato, H., Hattori, S., Kawamoto, S., Kudoh, I., Hayashi, A., Yamamoto, I., et al. In vivo gene gun-mediated DNA delivery into rodent brain tissue. Biochem Biophys Res Commun. 270, 163-170 (2000).
- Zhang, G., Selzer, M. E. In vivo transfection of lamprey brain neurons by gene gun delivery of DNA. Exp Neurol. 167, 304-311 (2001).
- Sohn, R. L., Murray, M. T., Schwarz, K., Nyitray, J., Purray, P., Franko, A. P., et al. In-vivo particle mediated delivery of mRNA to mammalian tissues: ballistic and biologic effects. Wound Repair Regeneration. 209, 287-296 (2001).
- O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue. J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).
- Klimaschewski, L., Nindl, W., Pimpl, M., Waltinger, P., Pfaller, K. Biolistic transfection and morphological analysis of cultured sympathetic neurons. J Neurosci Methods. 113, 63-71 (2002).
- Kettunen, P., Demas, J., Lohmann, C., Kasthuri, N., Gong, Y., Wong, R. O., et al. Imaging calcium dynamics in the nervous system by means of ballistic delivery of indicators. J Neurosci Methods. 11, 37-43 (2002).
- Gamper, N., Shapiro, M. S. Calmodulin mediates Ca2+-dependent modulation of M-type K+ channels. J Gen Physiol. 122, 17-31 (2003).
- Wirth, M. J., Wahle, P. Biolistic transfection of organotypic cultures of rat visual cortex using a handheld device. J Neurosci Methods. 125, 45-54 (2003).
- O'Brien, J., Lummis, S. C. Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells. Methods. 33, 121-125 (2004).
- Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. J Neurosci Methods. 141, 41-53 (2005).
- Chow, L., Levine, E. M., Reh, T. A. The nuclear receptor transcription factor, retinoid-related orphan receptor beta, regulates retinal progenitor proliferation. Mech Dev. 77, 149-164 (1998).
- Rockhill, R. L., Daly, F. J., MacNeil, M. A., Brown, S. P., Masland, R. H. The diversity of ganglion cells in a mammalian retina. J Neurosci. 22, 3831-3843 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 451, 115-126 (2002).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morophological survey of rat retinal ganglion cells. Vis Neurosci. 2019, 483-493 (2002).
- Stacy, R. C., Wong, R. O. Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J Comp Neurol. 456, 154-166 (2003).
- Strettoi, E., Pignatelli, V., Rossi, C., Porciatti, V., Falsini, B. Remodeling of second-order neurons in the retina of rd/rd mutant mice. Vision Res. 43, 867-877 (2003).
- Pignatelli, V., Strettoi, E. Bipolar cells of the mouse retina: a gene gun, morphological study. J Comp Neurol. 476, 254-266 (2004).
- Connaughton, V. P., Graham, D., Nelson, R. Identification and morphological classification of horizontal, bipolar, and amacrine cells within the zebrafish retina. J Comp Neurol. 477, 371-385 (2004).
- Edqvist, P. H., Hallbook, F. Newborn horizontal cells migrate bi-directionally across the neuroepithelium during retinal development. Development. 131, 1343-1351 (2004).
- Jakobs, T. C., Libby, R. T., Ben, Y., John, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell degeneration is topological but not cell type specific in DBA/2J mice. J Cell Biol. 171, 313-325 (2005).
- Qin, Y., Xu, G., Wang, W. Dendritic abnormalities in retinal ganglion cells of three-month diabetic rats. Curr Eye Res. 31, 967-974 (2006).
- Roizenblatt, R., Weiland, J. D., Carcieri, S., Qiu, G., Behrend, M., Humayun, M. S. Nanobiolistic delivery of indicators to the living mouse retina. J Neurosci Methods. 153, 154-161 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult Mammalian retinas. PLoS ONE. 2, e221 (2007).
