Summary
हम एक अंधेरे क्षेत्र माइक्रोस्कोपी एकल जीवित कोशिकाओं के भीतर subcellular गतिशीलता को मापने Gabor फ़िल्टरिंग - तरह के आधार पर विधि प्रदर्शित करता है. तकनीक organelles की संरचना में mitochondrial विखंडन जैसे परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है.
Protocol
1. कोशिकाओं तैयार हो रही है
- कोशिकाओं है कि दिन के पहले मढ़वाया गया Mitotracker हरे रंग के साथ mitochondria की प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए लेबल करने की आवश्यकता है.
- DMSO में Mitotracker हरे रंग की 4 ° सी फ्रीजर से पहले बनाया है, और हाथ के साथ कमरे के तापमान को गर्म 100 सुक्ष्ममापी शेयर समाधान निकालें. इसके अलावा बाहर गोजातीय महाधमनी endothelial कोशिकाओं (BAEC) सेल संस्कृति माध्यम भी पहले से तैयार है और 37 ° सी benchtop waterbath में गर्म ले.
- एक बार Mitotracker और संस्कृति के माध्यम गरम कर रहे हैं, डाकू में इन जगह के लिए अपने दस्ताने हाथ और 70% इथेनॉल समाधान के साथ कंटेनर के सभी बाहरी सतहों बाँझ सुनिश्चित करने. हुड प्रकाश पर बारी नहीं है, के रूप में फ्लोरोसेंट लेबल प्रकाश संवेदनशील है और जल्दी परिवेश कमरे प्रकाश में photobleach होगा.
- Mitochondrial लेबलिंग के लिए सही एकाग्रता बनाना बहुत महत्वपूर्ण है. बहुत कम mitochondria प्रभावी ढंग से नहीं लेबल है, जबकि बहुत अधिक Mitotracker विषाक्त प्रभाव हो सकता है. Mitotracker के 100 एनएम के एक एकाग्रता कोशिकाओं के साथ 45 मिनट के लिए incubated अच्छी तरह से काम करता है. इस एकाग्रता एक 15 एमएल ट्यूब में 10 एमएल संस्कृति के माध्यम Mitotracker शेयर के 100 μL जोड़कर तैयार करें. यह कम से कम एक प्रयोग के लिए बहुत कुछ कर देगा.
- लेबल मध्यम के साथ एक पाश्चर निर्वात लाइन से जुड़ा विंदुक के साथ पुराने मध्यम चूसने द्वारा मौजूदा मध्यम बदलें. तो तुरंत 6 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रत्येक पर कब्जा कर लिया संस्कृति लेबल माध्यम के 2 एमएल जोड़ने.
- क्योंकि फ्लोरोसेंट लेबल प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को जल्दी से प्रतिस्थापित सीधे कमरे प्रकाश को उजागर किए बिना. 6 हाथों से अच्छी तरह से थाली को कवर इस के लिए अच्छी तरह से काम करता है. कोशिकाओं इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए रहेगी.
2. ऑप्टिकल सेटअप तैयार हो रही है
- जबकि कोशिकाओं इनक्यूबेटर में प्रतीक्षा, हम ऑप्टिकल सेटअप पर बारी है. प्रकाशिकी कमरे में पारा आर्क दीपक पर पहली बारी है, कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप, कैमरा, और लेजर के बाद. फिर डिजिटल micromirror (डीएमडी) डिवाइस और कताई विसारक में प्लग.
- यकीन है कि ऑप्टिकल प्रक्षेपण खुर्दबीन ऐपिस के माध्यम से तलाश करने के लिए सुनिश्चित करें कि देखने के क्षेत्र चमकीले लेज़र प्रकाश द्वारा प्रबुद्ध है द्वारा गठबंधन है की जाँच करें.
- एक तंग वर्ग में लेंस कागज का एक टुकड़ा तह करके उद्देश्य साफ और hemostat के साथ कसकर समझ. डुबकी अमोनिया मुक्त गिलास सफाई समाधान में लेंस कागज कागज में एक छोटी राशि को अवशोषित. रैप अपने मुक्त हाथ पर कई बार hemostat किसी भी अतिरिक्त को दूर करने के लिए. मजबूती उद्देश्य भर में एक स्वच्छ, निरंतर ज़ोर से मारना एक छोर से दूसरे के लिए आवेदन, बीच में लेंस पर जा रहा उद्देश्य साफ कर लें. फिर से ज़ोर से मारना या साफ़ मत करो. इस्तेमाल कागज त्यागें.
- नमूना लोड करने के लिए, उद्देश्य अधिक विसर्जन तेल की 1-2 बूँदें छोटे छोड़ने जबकि उद्देश्य सभी तरह से नीचे के द्वारा graticule 63x तेल विसर्जन उद्देश्य पर जगह है. तब चरण में graticule जगह. तब उद्देश्य इतना है कि तेल का नमूना "पकड़ लेता है" बढ़ा. ऐपिस में नमूना ध्यान दें.
- संघनित्र संरेखित करने के लिए, इतना है कि यह केंद्रीय Kohler रोशनी में संघनित्र क्षेत्र रोकने के हेक्सागोनल बढ़त ध्यान केंद्रित करके गठबंधन है संघनित्र ऊंचाई समायोजित. यदि जरूरी हुआ तो देखने के क्षेत्र से अधिक केंद्र संघनित्र क्षेत्र संघनित्र केंद्रित knobs मोड़ द्वारा बंद करो. संघनित्र एपर्चर रोक बंद होना चाहिए.
- IPlab कार्यक्रम और इनपुट सेटिंग्स प्रारंभ RoperScientific Cascade 512 कैमरा संचालित करने के लिए. पुष्टि करें कि कैमरे के लिए स्थानांतरण मोड फ्रेम के लिए सेट कर दिया जाता है. "ध्यान केंद्रित मोल" कमांड चलाकर लाइव पूर्वावलोकन शुरू करो. सूचकांक उपसर्ग और जो छवियों को बचाया जा जाएगा फ़ाइल स्थान निर्धारित करें.
- RSImage कार्यक्रम और इनपुट सेटिंग्स प्रारंभ CoolSnap कार्यक्रम संचालित करने के लिए. Clocking मोड सामान्य करने के लिए सेट किया जाना चाहिए.
- DMD सॉफ्टवेयर प्रारंभ और स्क्रिप्ट मेनू पर अंधेरे क्षेत्र परितारिका, द्वारा पीछा जगह "लोड और रीसेट" कमांड और स्क्रिप्ट चलाएँ.
- DMD और Cascade 512 कैमरा LSM के लिए माइक्रोस्कोप optovar और viewport सेटिंग के द्वारा प्रकाश भेजें. इस DMD और गठबंधन प्रकाशिकी के माध्यम से छवि भेजने के लिए, सीसीडी पर लोमो छवि पेश करेगा. क्षेत्र अंधेरे छवि (लोमो) लाइव पूर्वावलोकन पर पहले से ही चल IPlab में प्रकट करना चाहिए. माइक्रोस्कोप के ठीक ध्यान समायोजित अगर लाइव पूर्वावलोकन पर आवश्यक छवि को ध्यान केंद्रित करने के लिए.
- कमांड "एकल अधिग्रहण का उपयोग देखने के क्षेत्र का एक स्नैपशॉट ले लो. जोखिम पर्याप्त उच्च छवि में संकेत के कम से कम 10000 मायने रखता है सुनिश्चित समय निर्धारित करें. अधिग्रहण के बाद, "बचाने के रूप में अनुक्रमित" कमांड का उपयोग डिस्क छवि को बचाने. Graticule की यह छवि देखने FOV () के क्षेत्र के आकार के उपाय.
- अब, graticule नमूना ताकि graticule FOV परे है ताकि केवल पृष्ठभूमि दिख रहा है चाल. एक क्षेत्र की एक पृष्ठभूमि छवि मोललंबे समय पर्याप्त जोखिम करने के लिए सुनिश्चित करें कि संकेत के कम से कम 5000 मायने रखता अधिग्रहण कर लिया है. इस छवि अनफ़िल्टर्ड छवियों की पृष्ठभूमि घटाव में सहायता करेगा.
3. Filterbank लोड हो रहा है और फ़िल्टर पृष्ठभूमि छवियों को प्राप्त करने के लिए सेटअप का उपयोग
- अब, हम Gabor फ़िल्टर पृष्ठभूमि छवियों को प्राप्त करने की आवश्यकता है. Gabor फिल्टर बैंक स्क्रिप्ट DMD नियंत्रण सॉफ्टवेयर के लिए लोड करें. पूरी स्क्रिप्ट चलाएँ DMD की जहाज पर स्मृति के लिए फिल्टर बफर, यह एक कुछ मिनट लग सकता है.
- एक बार पूरी स्क्रिप्ट buffered है, हम अब पृष्ठभूमि के फ़िल्टर्ड छवियों को प्राप्त कर सकते हैं. शुरू का उपयोग करें और DMD सॉफ्टवेयर के भीतर मार्कर को रोकने के लिए DMD हिदायत Gabor की तरह एक एक समय में फिल्टर करने के लिए इसी फिल्टर का केवल एक सेट लोड, और स्क्रिप्ट चलाएँ. जीना छवि पूर्वावलोकन क्षेत्र अंधेरे से है कि फिल्टर के लिए फ़िल्टर छवि बदलना चाहिए.
- IPlab में डिस्क से अधिग्रहण स्क्रिप्ट खोलें. समय जोखिम को समायोजित करने के लिए सुनिश्चित करें कि संकेत के कम से कम 2000 मायने रखता है अधिग्रहीत किया जा रहा है. DMD स्क्रिप्ट के रूप में चल रहा है, IPlab में लाइव पूर्वावलोकन रद्द करने और अधिग्रहण स्क्रिप्ट चलाने. यह स्वचालित रूप से अधिग्रहण, सूचकांक होगा और डिस्क पर फ़िल्टर छवि को बचाने.
- एक बार पहली छवि प्राप्त कर लिया है, स्क्रिप्ट बंद DMD सॉफ्टवेयर में चल रहा है और स्क्रिप्ट से इस्तेमाल किया आज्ञाओं को हटाने. और अगले फ़िल्टर सेट की शुरुआत और अंत में शुरू रोक मार्करों बदलें. IPlab में अधिग्रहण दोहराएँ.
- 3.4 कदम दोहराएँ जब तक पूरे filterbank इस्तेमाल किया गया है और सभी फ़िल्टर छवियों का अधिग्रहण किया गया है और बचाया.
4. कोशिकाओं चढ़ाना
- अब तक, कोशिकाओं को जल्द ही प्रयोग के लिए थाली करने के लिए तैयार हो जाएगा. प्रयोगशाला benchtop पर टांका लोहे में प्लग. 37 सी. सेंटीग्रेड l15 देखने मध्यम और गर्मी निकालें एक कागज तौलिया और एक Kimwipe के साथ एक काम स्टेशन बनाओ. Kimwipes फाड़ और twirling द्वारा कई wicks बनाओ. wicks और सेल थाली से तरल पदार्थ के हस्तांतरण में मदद मिलेगी.
- इस के बाद, हम नमूना थाली करने के लिए की जरूरत है. हम हमारी कोशिकाओं के थाली करने के लिए machined धातु नमूना धारकों का उपयोग करें, बीच में धातु की थाली के साथ "coverslip सैंडविच" बनाने. धातु प्लेट छेद प्रत्येक पक्ष पर grooves के सिरों को आधे रास्ते के बारे में विस्तार के ऊपरी परिधि के चारों ओर एक सिरिंज से वैक्यूम तेल की एक पतली मनका लागू करें. धीरे एक साफ नहीं दबाएँ. तेल पर 1 coverslip. थाली पलटें और छेद के चारों ओर तेल लागू. कमरा रोशनी बंद करें.
- अब हम इनक्यूबेटर कोशिकाओं से मिलता है, nitrile परीक्षा 70% इथेनॉल के साथ निष्फल दस्ताने के साथ इनक्यूबेटर सामग्री से निपटने. इनक्यूबेटर से सेल थाली निकालें, अपनी सांस पकड़ जबकि इनक्यूबेटर दरवाजा खुला है. कमरे प्रकाश जोखिम को कम करने के लिए सावधान रहें.
- निकालें coverslip है कि छह अच्छी तरह से थाली से प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, टिप्पण है कि पक्ष यह है कि अच्छी तरह से में चेहरे कोशिकाओं संलग्न के साथ की ओर है. ध्यान से दोनों पक्षों पर coverslip सूखी जब तक यह लगभग पूरी तरह से सूखे, जबकि रखते हुए ट्रैक जो की coverslip के पक्ष कोशिकाओं. फिर coverslip, सेल की ओर नीचे प्रेस, greased देखने के छेद पर धातु की थाली में, यकीन है कि कोई हवा अंतराल के तेल परत के भीतर रहते हैं बनाने. तेल एक निर्विवाद मुहर फार्म करने के लिए अनुमति देने के लिए l15 के माध्यम से कोशिकाओं को लोड करने के लिए करना चाहिए. एक बार जब आप इस का कुछ कर रहे हैं, थाली वापस फ्लिप करने पर.
- मढ़वाया कोशिकाओं में ऊपरी coverslip और धातु की थाली के बीच नाली के माध्यम से तरल मजबूर द्वारा l15 मध्यम पिपेट. एक समय में 200 μL pipetting अच्छी तरह से काम करता है. पहली मात्रा विंदुक तरल के साथ coverslips लगभग दूसरी तरफ नाली के लिए विस्तार के बीच sandwiched स्थान को भरने चाहिए.
- माध्यम की मढ़वाया कोशिकाओं में एक और 200 μL पिपेट, लेकिन इस समय, ग्रोव का विरोध ताकि मध्यम एक पक्ष से दूसरे करने के लिए बहती है पर एक बाती पकड़. यह कोशिकाओं washes और पुराने मध्यम के किसी भी अंश को हटा. इस कदम के दौरान तरल के भीतर बनाने से किसी भी बुलबुले को रोकने के सावधान रहें. इस प्रक्रिया 2-3 बार दोहराएँ प्रत्येक कुल्ला के लिए एक नया बाती का उपयोग.
- टांका लोहे हम में plugged याद है? अब समय है इसे इस्तेमाल किया जाता है. थाली उल्टा एक बार पलटें, किनारों से थाली का समर्थन ताकि तरल सेल जलाशय में फंस गया है और ड्रिप नीचे नहीं कर सकते. Valap बीकर में टांका लोहे डुबकी. यह जल्दी valap जो फिर टांका लोहे टिप करने के लिए चिपटना जाएगा के कुछ पिघल जाएगा. ध्यान से नीचे (जो अब ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है) coverslip एक applicator के रूप में टांका लोहे टिप का उपयोग कर के किनारों के आसपास पिघला हुआ valap लागू. सूई और आवेदन जब तक तुम जाओ coverslip परिधि के आसपास सभी तरह, धातु की थाली के लिए coverslip सील जारी रखें.
- नीचे coverslip कोशिकाओं उस पर बढ़ रहा है, और उजागर तरफ सूखे अप माध्यम से अवशेषों हो सकता है. एक Kimwipe और Cleanin डांट लगाई द्वारा coverslip सतह से किसी भी अवशेषों को साफजी फिसलने उद्देश्य सफाई बहुत पसंद है एक एकल गति में coverslip. यह सुनिश्चित करता है कि coverslip केंद्र में जहां यह देखा जाएगा साफ है.
- टांका लोहे हाल चलाना और इनक्यूबेटर के लिए 6 अच्छी तरह से थाली वापस एक ही रोकथाम और बाँझपन प्रक्रियाओं देख. प्रकाशिकी प्रयोगशाला और माउंट के रूप में 2.4 और 2.5 कदम में वर्णित उद्देश्य पर चढ़ाया कोशिकाओं ले लो.
5. प्रयोग का आयोजन
- स्वस्थ कोशिकाओं का एक अच्छा क्षेत्र का पता लगाएं.
- देखने के क्षेत्र के एक अंधेरे क्षेत्र छवि मोल. अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) में खुर्दबीन संरेखित करें और एक डीआईसी छवि अधिग्रहण. सुनिश्चित करें कि जोखिम बार लंबे समय से करने के लिए सुनिश्चित करें कि पर्याप्त संकेत है पर्याप्त हैं.
- अब हम दूसरे कैमरे पर छवियों फ्लोरोसेंट हासिल है. CoolSnap पर डीआईसी छवियों प्राप्त करने के लिए, हम एक नीले रंग संघनित्र से जुड़ी एलईडी, यह जगह है और यह आवश्यक के रूप में हटाने का उपयोग करें. जबकि माइक्रोस्कोप डीआईसी में अभी भी गठबंधन किया है, 1.0x और viewport के लिए 100% द्विनेत्री माइक्रोस्कोप optovar सेटिंग के द्वारा CoolSnap प्रकाश भेजें. ऐपिस से कैमरे के लिए छवि को हटाने की. प्लेस क्षेत्र रोशन और RSimage में FOV पूर्वावलोकन और ठीक ध्यान केंद्रित समायोजित यदि आवश्यक संघनित्र पर एलईडी. डीआईसी छवि अधिग्रहण और डिस्क को बचाने के. नोट कैसे FOV Cascade के कैमरे से प्राप्त एक से अलग है. इन छवियों को प्रयोग के बाद विश्लेषण चरण के दौरान पंजीकृत होना होगा.
- Fluorescein filtercube फिल्टर क्यूब का समायोजन करके एक प्रतिदीप्ति छवि प्राप्त करते हैं. संक्षेप में प्रतिदीप्ति उत्तेजना का उपयोग कर खुर्दबीन पर बदल कर एक छवि अधिग्रहण और फिर इसे बंद के रूप में जल्द ही के रूप में अधिग्रहण पूरा हो गया है. चूंकि हम डीआईसी में नमूना केंद्रित, प्रतिदीप्ति छवि के रूप में अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित किया है. इस प्रतिदीप्ति में जोखिम समय पर बचाता है, जिससे धीमा photobleaching. डिस्क प्रतिदीप्ति छवि को बचाओ.
- अब हम को फ़िल्टर छवियों प्राप्त की है. क्षेत्र अंधेरे खुर्दबीन रीसेट और LSM बंदरगाह के माध्यम से 2.9 के रूप में प्रकाश को पुनः भेजें.
- 3.3-3.5 में के रूप में पूरे गेबर filterbank स्क्रिप्ट चलाएँ. अब हम एक समय बिंदु के लिए डाटा अधिग्रहण पूरा कर लिया है.
6. मध्यम स्विचिंग staurosporine (अजजा) के लिए कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए, और प्रयोग भर मध्यम बनाए रखने
- जबकि कोशिकाओं को अभी भी मंच पर और देखने के क्षेत्र को परेशान किए बिना, बाहर 1 DMSO में एक 4 मिमी अनुसूचित जनजातियों के शेयर समाधान से बने अनुसूचित जनजातियों के सुक्ष्ममापी समाधान युक्त उसी के लिए नियमित रूप से मध्यम एल-15 स्विच. Wicking मीडिया के स्विच 4.6 चरणों में वर्णित विधि का उपयोग करें.
- अब, हम बाद में समय अंक के लिए 5.2-5.6 चरणों को दोहराएँ. हम इस प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक प्रयोग पूरा हो गया है.
- प्रयोग के दौरान, और अधिक मध्यम ताकि नमूना नहीं कुम्हलाना है जोड़ा जा करना होगा. इस मंच से हटाने के बिना और FOV परेशान बिना सेल प्लेट के ग्रोव में मध्यम pipetting द्वारा पूरा किया है.
7. प्रतिनिधि परिणाम
प्रयोग के समापन पर, एकत्रित किए गए डेटा की जरूरत है कि subcellular संरचनात्मक डेटा निकालने के लिए संसाधित किया जा फ़िल्टर छवियों की एक बड़ी संख्या में शामिल होंगे. दो उदाहरण एक ऑप्टिकल फिल्टर फिल्टर एस अवधि = 0.95μm, गाऊसी लिफाफा मानक विचलन = एस / 2 = 0.45μm, और झुकाव Φ = 0 ° करने के लिए Φ = 160 ° 20 में से 9 Gabor की तरह फिल्टर से मिलकर बैंक के लिए दिखाए जाते हैं ° वेतन वृद्धि. (और अधिक विस्तार के लिए [1] यह भी देखें).
उदाहरण 1: समुद्री डायटम
हम पहले उन्मुख सुविधाओं है कि अंधेरे क्षेत्र इमेजिंग (लोमो) (छवि 1) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे के साथ एक समुद्री डायटम नमूना (कैरोलिना जैविक आपूर्ति कंपनी) के लिए हमारी अभिविन्यास संवेदनशील फिल्टर बैंक लागू होता है. ऑप्टिकली फ़िल्टर छवियों तुलना के लिए नमूने के अनफ़िल्टर्ड छवि के बगल में दिखाए जाते हैं.
चित्रा 1: डार्क (लोमो) क्षेत्र और समुद्री डायटम ऑप्टिकली फ़िल्टर छवि. हम छवि (सबसे बाईं पैनल में सफेद तीर) के निचले सही में डायटम का विश्लेषण करेगा.
नौ डायटम के Gabor फ़िल्टर छवियों का सेट वस्तु उन्मुखीकरण और गोलाई लिए पिक्सेल द्वारा पिक्सेल प्रोसेस किया गया. प्रसंस्करण (1) प्रत्येक पिक्सेल पर सभी नौ Gabor फ़िल्टर छवियों के मापा प्रतिक्रिया संक्षेप संकेत जिससे प्रतिक्रिया महत्व एन्कोडिंग प्रतिक्रिया के समग्र परिमाण निर्धारित करने के लिए, और (2) Gabor फिल्टर अभिविन्यास ढूँढने के शामिल, Φ, जिस पर प्रतिक्रिया है अधिकतम और जिससे हद तक जो प्रत्येक पिक्सेल पर वस्तुओं एक वरीय उन्मुखीकरण एन्कोडिंग सभी कोण के लिए औसत प्रतिक्रिया के लिए यह अधिक से अधिक प्रतिक्रिया के अनुपात ले. उन्मुखीकरण की डिग्री निकट कण के ज्यामितीय पहलू अनुपात से संबंधित है. अंजीर में. 2B, वेंई पिक्सेल का समग्र फिल्टर (पैरामीटर 1) बैंक और अभिविन्यास या पहलू अनुपात (2 पैरामीटर) की डिग्री करने के लिए प्रतिक्रिया रंग संतृप्ति और रंग में इनकोड किया गया है, क्रमशः. 1 के पास एक पहलू अनुपात (नीला) क्षेत्रों में जिसमें वहाँ कोई पसंदीदा प्रतिक्रिया कोण में मौजूद है, जबकि अधिक से अधिक मानों (लाल) जिन क्षेत्रों में एक उच्च पसंदीदा कोण प्रतिक्रिया मौजूद है संकेत मिलता है. बुनियाद कण उन्मुखीकरण एक तरकश साजिश (छवि 2C), जहां प्रत्येक पंक्ति बारीकी से अंतर्निहित स्थानीय वस्तु अनफ़िल्टर्ड क्षेत्र अंधेरे (छवि 2A) में दिखाई उन्मुखीकरण के साथ सहमत में एन्कोडेड है.
चित्रा 2: एक: डायटम डार्क क्षेत्र छवि. बी: ऑब्जेक्ट ओरिएंटेशन छवि. रंग पैमाने अभिविन्यास (पहलू अनुपात) की डिग्री इंगित करता है जबकि चमक कुल Gabor फिल्टर प्रतिक्रिया के महत्व encodes. सी: प्रतिक्रिया ≥ तीव्रता अधिकतम के 10% के साथ वस्तुओं का उन्मुखीकरण . रेखा खंड इसी संरचना के लंबे अक्ष को इंगित करता है .
उदाहरण 2: apoptotic कोशिकाओं
यहाँ हम गोजातीय endothelial staurosporine कि डायटम के रूप में एक ही रास्ते में प्रोसेस किया गया (अजजा) के साथ इलाज किया कोशिकाओं फ़िल्टर छवियों को दिखाने के. चित्र 3 एक अनफ़िल्टर्ड अंधेरे समय टी पर नौ फ़िल्टर छवियों =- 180 मिनट के साथ साथ क्षेत्र (लोमो) कोशिकाओं की छवि दिखाता है. अनुसूचित जनजातियों उपचार से पहले.
चित्रा 3: डार्क (लोमो) क्षेत्र और एक क्षेत्र के ऑप्टिकली फ़िल्टर छवियों के कई रहने वाले endothelial कोशिकाओं से युक्त.
फ़िल्टर छवियों को बाद में अनुसूचित जनजातियों के इलाज के बाद तीन घंटे की अवधि के लिए हर 20 मिनट का अधिग्रहण. चित्र 4a समय के एक समारोह के रूप में कोशिकाओं का एक पहलू अनुपात नक्शे से पता चलता है. इस मामले में रंग रंग के रूप में चित्र में रंग रंग के लिए ओरिएंटेशन (लेबल orientedness) की डिग्री का प्रतिनिधित्व करता है. ऊपर 2b. हालांकि, पहलू अनुपात चमक औसत फिल्टर प्रतिक्रिया द्वारा भारित नहीं था. इन कोशिकाओं में mitochondria लेबल (4b छवि) के प्रतिदीप्ति छवियों के साथ हमारे पहलू अनुपात नक्शे दर्ज करके, हमने निर्धारित किया है कि पहलू अनुपात ड्रॉप मापा सेलुलर mitochondria युक्त क्षेत्रों तक ही सीमित था और mitochondrial विखंडन में जो सीधे मनाया जा सकता है के साथ सहवर्ती था एक ही कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति छवियों. चित्र 5 समय apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं में समय के एक समारोह के रूप में पहलू अनुपात में परिवर्तन का चित्रण भूखंडों से पता चलता है. प्रत्येक कोशिका के भीतर, वहाँ टी पर पहलू अनुपात में एक बूंद है = क्षेत्रों है कि फ्लोरोसेंट mitochondria के साथ रजिस्टर में 6-10 मिनट, लेकिन क्षेत्रों है कि मंद पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति क्षेत्रों के साथ रजिस्टर में नहीं.
चित्रा 4: पहलू अनुपात (क) और प्रतिदीप्ति (ख) endothelial कोशिकाओं apoptosis inducer, staurosporine के साथ इलाज की छवियों .
चित्रा 5: टाइम कण staurosporine के साथ इलाज endothelial कोशिकाओं में पहलू अनुपात (orientedness) में कमी की तुलना भूखंडों . व्यक्तिगत निशान एकल कक्षों के भीतर समय के भूखंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं. orientedness में ड्रॉप कोशिकाओं है कि फ्लोरोसेंट पैनल (बाएं) mitochondria के साथ रजिस्टर के क्षेत्रों तक ही सीमित है और शेष पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति क्षेत्रों (सही पैनल) से अनुपस्थित है.
अब है कि हम निर्धारित किया है कि पहलू अनुपात ड्रॉप mitochondrial विखंडन से मेल खाती है है, हम इन कोशिकाओं में apoptosis प्रेरित कोशिकाओं लेबल बिना हमारे ऑप्टिकल स्कैटर विधि का उपयोग विखंडन को मापने कर सकते हैं, और इस पर अलग आनुवंशिक और प्रयोगात्मक शर्तों के प्रभाव का अध्ययन गतिशील.
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Discussion
विधि वस्तु है कि कण आकार या उदाहरण के लिए अभिविन्यास सांकेतिक शब्दों में बदलना हो सकता है की पैदावार morphometric नक्शे के ऊपर वर्णित है. यह जानकारी संरचनात्मक कई मायनों में इस्तेमाल किया जा सकता है:
- यह एक प्रारंभिक स्क्रीन है कि एक विशिष्ट उपचार के दौरान बदल रहे हैं और फिर आगे विशिष्ट आणविक और जैव रासायनिक assays के साथ इन क्षेत्रों का विश्लेषण ऊतक या सेल क्षेत्रों की पहचान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यह प्रतिदीप्ति के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कोशिकाओं है कि subcellular संरचना (इस विधि द्वारा) की मात्रात्मक विशेषताओं के साथ आणविक गतिविधि (प्रतिदीप्ति द्वारा) का एक साथ समझ को जोड़ती है एक बहुविध विश्लेषण उपज.
- एक बार एक विशिष्ट संरचनात्मक प्रतिक्रिया एक विशिष्ट जैविक प्रक्रिया (उदाहरण के apoptosis) में एक विशिष्ट organellar गतिविधि के साथ सहसंबद्ध है, विधि अलग आनुवंशिक और प्रयोगात्मक इस संरचनात्मक प्रतिक्रिया को प्रभावित करने की स्थिति के लिए किसी भी स्क्रीन के लिए प्रतिदीप्ति लेबल के बिना इस्तेमाल किया जा सकता है.
हम तारीख करने के लिए पता चला है कि विधि कण आकार में 30-50nm [2] के आदेश पर मतभेद के प्रति संवेदनशील है. हम पता चला है कि विधि कण अभिविन्यास और पहलू अनुपात में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है [3] और कण पहलू अनुपात में एक कमी apoptosis प्रेरित mitochondrial विखंडन (05/04 ऊपर Figs.) के साथ संगत.
2 उदाहरण के परिणाम बताते हैं कि हमारे विधि सेलुलर समारोह की गतिशील माप है कि विशिष्ट organellar समारोह के संदर्भ में व्याख्या की जा सकती है और कि प्रतिदीप्ति लेबल या exogenous रंजक के बिना एकत्र किया जा सकता है है परमिट. हालांकि, विशेष रूप से लेबल organelles के खिलाफ मापा प्रतिक्रियाओं का प्रारंभिक सत्यापन आवश्यक था. एक बार इस प्रारंभिक सत्यापन पूरा हो गया है, organellar गतिशीलता हमारे लेबल से मुक्त विधि के साथ सीधे जांच सकता है.
कई सेलुलर शर्तों पद्धति लागू है, और कक्ष के भीतर विभिन्न organelles के स्थान के साथ correlating हमारे गतिशील संरचनात्मक माप के रूप में हम वह mitochondria के साथ किया था, अंततः गतिशील संरचनात्मक व्यवहार के एक पुस्तकालय है कि uniquely विशिष्ट सेलुलर राज्यों चिह्नित कर सकते हैं करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ( जैसे, apoptosis oxidative और चयापचय तनाव, भड़काऊ प्रतिक्रिया आदि) .. यह जानकारी आगे एक "सेल राज्य विश्लेषक" जो नैदानिक सेल विश्लेषण में दवाओं की खोज सहित आवेदनों की एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है में शामिल किया जा सकता है है.
यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यहाँ उल्लिखित विधि जिसमें ऑप्टिकल तितर बितर एक सूक्ष्म इमेजिंग प्रणाली में अधिग्रहीत डेटा के लिए विशिष्ट subcellular गतिशीलता निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक सामान्य दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. हालांकि, विशिष्ट उपकरण इस्तेमाल में काफी सुधार किया जा सकता है. विशेष रूप में, स्थानिक फ़िल्टरिंग के लिए स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक की मौजूदा पसंद करने के लिए डाटा अधिग्रहण की दक्षता, स्थानिक आवृत्ति संकल्प, और ऑप्टिकल संकेत throughput के अधिकतम इष्टतम नहीं हो सकता. रंगीन और ज्यामितीय डिजिटल माइक्रो दर्पण यहां इस्तेमाल किया डिवाइस के साथ जुड़े aberrations [3] में चर्चा कर रहे हैं. वर्तमान में हम संभावित फायदे और एक राज्य के-the-कला लिक्विड क्रिस्टल डिवाइस की कमियां DMD की जगह में इन मुद्दों को कम करने की जांच कर रहे हैं. इसके अलावा, डाटा अधिग्रहण के लिए डिवाइस, स्थानिक फ़िल्टरिंग और माइक्रोस्कोप नियंत्रण को अलग से मानव उपयोगकर्ता द्वारा actuated हैं. यह बहुत अधिग्रहण के समय जहां फ़िल्टर छवियों की एक बड़ी संख्या प्रसंस्करण से पहले एकत्र करने की आवश्यकता है सीमा. इस प्रकार, सेटअप के स्वचालन अधिग्रहण समय सीसीडी जोखिम है, जो करने के लिए शोर संकेत करने पर्याप्त के लिए फ़िल्टर्ड छवि प्रति मिलीसेकेंड के 10 तक पहुँचने की उम्मीद है की अवधि के अनुरूप बनाना जरूरी है. टेम्पोरल संकल्प में यह वृद्धि भी हमें और अधिक ठीक से जीवित कोशिकाओं के भीतर organelles के संरचनात्मक गतिशीलता विशेषताएँ अनुमति देगा. इसलिए हम सक्रिय रूप से एक स्वनिर्धारित ग्राफिक यूजर इंटरफेस है कि हार्डवेयर के नियंत्रण को एकजुट और खुर्दबीन नियंत्रण, सीसीडी छवि अधिग्रहण, और स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक पर ऑप्टिकल फ़िल्टरिंग सहित उसके घटकों के actuation व्यवस्थित कर सकते हैं विकसित करने पर काम कर रहे हैं.
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Disclosures
और आविष्कार के प्रकटीकरण, Rutgers विश्वविद्यालय डॉकेट 09-049 # तरीकों के कुछ पहलुओं को शामिल किया गया है.
Acknowledgments
माइक्रो दर्पण इस शोध में डिवाइस Whitaker फाउंडेशन अनुदान द्वारा आरजी-02-+०६८२ एन Boustany के लिए वित्त पोषित किया गया था. चल रहे काम एन Boustany NSF-DBI-0852857 अनुदान द्वारा वित्त पोषित है. आरएम Pasternack आंशिक रूप से एक Rutgers प्रेसिडेंसियल ग्रेजुएट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया. हम भी iBMK उपयोगी ऑप्टिकल फ़िल्टरिंग रणनीतियों के बारे में चर्चा के लिए अपने अध्ययन और डॉ. डी.एन. Metaxas में इस्तेमाल किया कोशिकाओं के लिए डॉ. ई. व्हाइट धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | Low glucose DMEM | |
| Liebowitz L15 medium | Invitrogen | Without phenol red | |
| L-glutamine | Invitrogen | ||
| Mitotracker Green | Invitrogen | ||
| Bovine Brain Extract | Clonetics | ||
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | ||
| Heparin | Sigma-Aldrich | ||
| Staurosporine | Sigma-Aldrich | ||
| Dymethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| DMD | Texas Instruments | TI 0.7 XGA DMD 1100 | |
| CCD | Roper Scientific | Cascase 512B | High (16 bit) dynamic range CCD |
| CCD | Roper Scientific | Coolsnap cf |
References
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- Zheng, J. -Y., Pasternack, R. M., Boustany, N. N. Optical scatter imaging with a digital micromirror device. Optics Express. 17 (22), 20401-20414 (2009).
