Optiska spridningen Mikroskopi Baserat på tvådimensionella Gabor Filter

Summary

Vi visar ett mörkt fält mikroskopi metod som bygger på Gabor-liknande filter för att mäta subcellulära dynamiken inom de enskilda levande celler. Tekniken är känslig för förändringar i strukturen av organeller, som mitokondrier fragmentering.

Abstract

Vi visar en mikroskopisk instrument som kan mäta subcellulära textur som härrör från organell morfologi och organisation inom ofärgade levande celler. Det föreslagna instrumentet utökar känsligheten av etikett-fri optisk mikroskopi till nanoskala förändringar i organell storlek och form och kan användas för att påskynda studiet av struktur och funktion relation avseende organell dynamiken underliggande fundamentala biologiska processer som programmerad celldöd eller cellulära differentiering. Mikroskopet kan enkelt implementeras på befintliga mikroskopi plattformar, och kan därför spridas till enskilda laboratorier, där forskarna kan implementera och använda de metoder som föreslås med obegränsad tillgång.

Den föreslagna tekniken är kunna karaktärisera subcellulära struktur genom att observera cellen genom tvådimensionella optiska Gabor filter. Dessa filter kan anpassas till förnuft med nanoskala (10-tals nm) känslighet, specifika morfologiska attribut som hör till storlek och orientering icke-sfäriska subcellulära organeller. Samtidigt som bygger på kontrasten genereras av elastisk spridning, inte lita på tekniken inte på en detaljerad invers spridning modell eller om Mie teorin att extrahera morfometriska mätningar. Denna teknik är därför tillämplig på icke-sfäriska organeller som en exakt teoretisk scatter beskrivning inte är lätt att få, och ger distinkta morfometriska parametrar som kan erhållas inom ofärgade levande celler för att bedöma deras funktion. Tekniken är en fördel jämfört med digital bildbehandling i att den fungerar direkt på objektets fält omvandla snarare än discretized objektets intensitet. Det är inte beroende av hög bild provtagning och kan därför användas för att snabbt skärmen morfologiska aktivitet inom hundratals celler åt gången, vilket avsevärt underlättar studiet av organell struktur bortom enskilda organell segmentering och återuppbyggnad av fluorescens konfokalmikroskopi av mycket förstorade digitala bilder begränsat synfält.

I den här demonstrationen visar vi data från en marina kiselalger för att illustrera metoden. Vi visar också preliminära data som samlas in från levande celler för att ge en bild av hur metoden kan tillämpas på ett relevant biologiskt sammanhang.

Protocol

1. Att få cellerna redo

1. De celler som var klädd dagen innan behöver märkas med Mitotracker grönt för fluorescens avbildning av mitokondrier.
2. Ta bort 100-lösning mikroM lager av Mitotracker grönt i DMSO tidigare gjorts från 4 ° C frys och värmas till rumstemperatur med handen. Ta också reda på nötkreatur aorta endotelceller (BAEC) cellkulturmedium även tidigare beredd och värm till 37 ° C i bänk vattenbad.
3. När Mitotracker och odlingsmedium som värms, placera dessa i huven och se till att sterilisera dina handskar på händerna och alla yttre ytor i containrar med 70% etanol-lösning. Slå inte på motorhuven ljuset, eftersom fluorescerande märkningen är ljuskänsligt och kommer snabbt photobleach med ljuset i rummet.
4. Att göra rätt koncentrationen för mitokondriella märkningen är mycket viktigt. För lite kommer inte att märka mitokondrierna effektivt, medan för mycket Mitotracker kan ha toxiska effekter. En koncentration av 100 nm Mitotracker inkuberas under 45 minuter med cellerna fungerar bra. Förbered denna koncentration genom att tillsätta 100 mikroliter av Mitotracker lager till 10 ml odlingsmedium i ett 15 ml rör. Detta kommer att göra gott för åtminstone ett experiment.
5. Ersätt den befintliga mediet med den märkta mediet genom att suga ut det gamla mediet med en pasteurpipett kopplad till vakuum linjen. Sedan omedelbart tillsätt 2 mL av den märkta medellång till varje ockuperade kulturen väl i 6 brunnar.
6. Eftersom den fluorescerande märkningen är känslig för ljus, ersätta celler i inkubatorn snabbt utan att utsätta för direkt rumsbelysning. Omfattar 6 brunnar med händerna fungerar bra för detta. Cellerna kommer att stanna i inkubatorn i 45 minuter.

2. Att få den optiska installationen klar

1. Medan cellerna vänta i inkubatorn, måste vi vända på den optiska installationen. I optik rummet, först slår på kvicksilverströmriktare lampan, följt av datorn, mikroskop, kameror och laser. Anslut sedan den digitala Micromirror Device (DMD) och spinning diffusor.
2. Kontrollera att se till att den optiska lansering är i linje genom att titta i mikroskopet okularet för att säkerställa att synfältet starkt belyses av laserljus.
3. Rengör mål genom att vika en bit linspapper i en tät fyrkant och greppa hårt med en hemostat. Doppa linspapper till ammoniak-fri glas rengöringslösning för att absorbera en liten mängd in i papperet. Rap de hemostat på din fria hand flera gånger för att avlägsna överflödigt. Torka av målet genom att stadigt tillämpa ett rent, kontinuerlig svepa över mål från ena änden till den andra, som går över linsen i mitten. Återanvänd inte svepa eller skrubba. Släng använt papper.
4. För att ladda provet, placera fokalplattan över 63x oljeimmersion målet genom att tappa 1-2 små droppar av immersionsolja över målet samtidigt som målet är hela vägen ner. Placera sedan fokalplattan i scenen. Då höjer målsättningen så att oljan "tar" provet. Fokus provet i okularet.
5. Att anpassa kondensorn, justera kondensorn höjden så att det är anpassat i centrala Kohler belysning genom att fokusera den sexkantiga kanten av kondensorn fältet stopp. Centrera kondensorn fältet stannar över synfältet om nödvändigt genom att vrida kondensator centrering rattarna. Kondensorn bländare stopp bör stängas.
6. Starta IPlab programmet och skriv in inställningarna för att driva RoperScientific Cascade 512 kamera. Kontrollera att kameran är inställd på frame mode. Starta förhandsgranskningen genom att köra "Hämta fokus"-kommandot. Ange index prefixet och fil plats som bilderna ska sparas.
7. Starta RSImage programmet och skriv in inställningarna för att driva CoolSnap programmet. Överklockning läget bör sättas till det normala.
8. Starta DMD programmet och placera det mörka fältet iris på manuset menyn, följt av "Load och Reset"-kommandot och köra skriptet.
9. Skicka ljuset till DMD och Cascade 512 kamera genom att ställa in mikroskopet optovar och vyport till LSM. Detta kommer att skicka bilden via DMD och de anpassade optik, projicera DF bilden på CCD. Den mörka fältet (DF) bild ska visas på förhandsgranskningen som redan pågår i IPlab. Justera fina fokus för mikroskop om det är nödvändigt att fokusera bilden på live-förhandsvisning.
10. Ta en ögonblicksbild av synfältet med hjälp av "köpa singeln" kommando. Ställ in exponeringstiden tillräckligt hög för att säkerställa minst 10000 fall av signal i bilden. Efter förvärvet, använd "spara som indexerade" för att spara bilden till disk. Denna bild av fokalplattan mäter storleken på synfältet (FOV).
11. Nu, flytta fokalplattan provet så att fokalplattan är bortom FOV så att endast bakgrunden syns. Skaffa en bakgrundsbild av området på etttillräckligt lång exponeringstid för att se till att minst 5000 räknas av signal förvärvas. Denna bild kommer att hjälpa i bakgrunden subtraktion av den ofiltrerade bilder.

3. Fylla på filterbank och använda inställningen att förvärva filtreras-bakgrundsbilder

1. Nu måste vi skaffa Gabor-filtrerad bild av bakgrunden. Ladda Gabor filtret banken skriptet till DMD styrprogram. Kör hela manuset att buffra filtren för att det inbyggda minnet av DMD, detta kan ta några minuter.
2. När hela manuset buffras, kan vi få nu filtreras bilder av bakgrunden. Använd start och stopp markörer inom DMD programvara för att instruera DMD att ladda endast en uppsättning filter som motsvarar en Gabor-liknande filter åt gången, och kör skriptet. Sökarbilden förhandsgranskning ska ändra från mörkt fält till den filtrerade bilden för filtret.
3. Öppna förvärvet skriptet i IPlab från disk. Justera exponeringen tid att se till att minst 2000 fall av signal som är under uppköp. Eftersom DMD skriptet körs avbryta förhandsgranskningen i IPlab och kör förvärvet manus. Detta kommer automatiskt att förvärva, index och spara den filtrerade bilden till disk.
4. När den första bilden förvärvas, stoppa skriptet körs i DMD mjukvara och ta bort kommandon som används av skriptet. Byt start och markörer stopp i början och slutet av nästa filtret set. Upprepa förvärvet i IPlab.
5. Upprepa steg 3,4 tills hela filterbank har använts och alla filtrerade bilder har förvärvat och sparat.

4. Plating cellerna

1. Genom att nu kommer cellerna snart redo att plattan för experimentet. Anslut lödkolv på lab bänk. Ta bort L15 visning medellång och värme till 37 ° C. Gör en arbetsstation med en pappershandduk och en Kimwipe. Gör flera vekar genom att riva och snurrande Kimwipes. Det vekar kommer att bidra till att överföra vätska till och från cellen plattan.
2. Efter detta måste vi plattan provet. Vi använder den bearbetade innehavare metall prov till tallrik våra celler, vilket gör en "täckglas sandwich" med metallplattan i mellan. Applicera en tunn sträng av vakuum fett från en spruta runt övre periferi metallplattan hålet sträcker sig ungefär halvvägs till ändarna av spåren på varje sida. Tryck försiktigt ett rent nej. 1 täckglas på fett. Vänd plåten över och fetta runt hålet. Stäng av rummet ljus.
3. Nu får vi cellerna från inkubatorn, hantering inkubatorn innehållet med handskar nitril examen steriliseras med 70% etanol. Ta bort cellen plattan från kuvösen och håller andan medan inkubatorn dörren är öppen. Var noga med att minimera exponeringen för rumsbelysning.
4. Ta bort täckglas som kommer att användas för experimentet från sex brunnar, och noterar att den sida som var uppåt i brunnen är den sida med celler bifogas. Försiktigt torka täckglas på båda sidor tills den är nästan helt torr, och samtidigt hålla koll på vilken sida av täckglas har cellerna. Tryck sedan på täckglas, cell nedåt, in i smorda metallplatta över visning hålet, se till att inga luftspalter kvar i fettet lagret. Fettet måste bilda en vattentät försegling för att tillåta oss att ladda cellerna med L15 mediet. När du är säker på detta, vänd plattan tillbaka.
5. Pipettera L15 mediet i pläterat cellerna genom att tvinga vätskan genom skåran mellan den övre täckglas och metallplattan. Pipettering 200 mikroliter i taget fungerar bra. Den första volymen pipett bör fylla utrymmet inklämt mellan täckglas med vätskan sträcker sig nästan till spåret på andra sidan.
6. Pipettera ytterligare 200 mikroliter av medium i pläterade celler, men den här gången, håll en veke på motsätta lund så att mediet flödar från en sida till en annan. Detta tvättar cellerna och tar bort alla spår av det gamla mediet. Var noga med att förhindra att bubblor bildas i vätskan under detta steg. Upprepa denna process 2-3 gånger med en ny veke för varje sköljning.
7. Kom ihåg lödkolven vi isatt? Nu är det dags blir det används. Vänd plåten upp och ner en gång, stödja plattan från kanterna så att vätskan är fångad i cellen reservoar och kan inte droppa ner. Doppa lödkolv i valap bägaren. Detta kommer snabbt att smälta en del av de valap som sedan kommer att hålla fast vid lödkolven spetsen. Applicera den smälta valap runt kanterna på botten täckglas (som nu är vänd uppåt) med hjälp av lödkolven spetsen som en applikator. Fortsätt doppning och gäller till och en man går hela vägen runt täckglas omkrets, försegla täckglas till metallplattan.
8. Botten täckglas har celler som växer på den, och kanske har rester från den torkade upp medium på den exponerade sidan. Rengör eventuella rester från täckglas ytan genom klumpning en Kimwipe och cleaninG täckglas i en enda glidande rörelse likt rengöring målet. Detta säkerställer att täckglas är renaste i centrum där det kommer att uppfattas.
9. Koppla ur lödkolv och returnera 6-brunnar till inkubatorn iaktta samma inneslutning och förfaranden sterilitet. Ta pläterade celler till optik labbet och montera på det mål som beskrivs i steg 2,4 och 2,5.

5. Genomföra experimentet

1. Hitta ett trevligt område fräschare celler.
2. Förvärva ett mörkt fält bild av synfältet. Justera mikroskopet i differential interferens kontrast (DIC) och skaffa en DIC bild. Se till att exponeringen tider är tillräckligt lång för att säkerställa att signalen är tillräcklig.
3. Nu har vi att förvärva fluorescerande bilderna på den andra kameran. För att få DIC bilder på CoolSnap använder vi en blå lysdiod ansluten till kondensorn, som ersätter den och ta bort det som behövs. Medan mikroskop är fortfarande rakt i DIC, Skicka ljuset till CoolSnap genom att ställa in mikroskopet optovar till 1.0x och vyport till 100% kikare. Vidarekoppla bilden från okularet till kameran. Placera lampan över kondensorn för att lysa upp området och förhandsgranska FOV i RSimage och justera fina fokus om det behövs. Skaffa en DIC bilden och spara till disk. Lägg märke till hur FOV skiljer sig från den som erhålls från Cascade kameran. Dessa bilder kommer att registreras under analysfasen efter experimentet.
4. Skaffa en fluorescens bild genom att justera filtret kuben till fluorescein filtercube. Skaffa en bild genom att kort slå på fluorescens excitation med mikroskop och sedan stänga av den så snart förvärvet har slutförts. Eftersom vi fokuserade provet i DIC är fluorescens bilden fokuserade också. Detta sparar på exponeringstid i fluorescens, och därmed bromsa fotoblekning. Spara fluorescens bilden till disk.
5. Nu måste vi skaffa de filtrerade bilderna. Återställ mikroskop för att mörka fält och skicka ljus genom LSM hamnen som i 2,9.
6. Kör hela Gabor filterbank manus som i 3,3-3,5. Vi har nu slutfört datainsamling för en tidpunkt.

6. Växla mediet att exponera cellerna för staurosporine (STS), och upprätthålla mediet under hela försöksperioden

1. Medan cellerna fortfarande är på scenen och utan att störa synfältet, byta ut den vanliga L-15 medium för samma som innehåller en 1 mikroM lösning av STS gjord av ett 4 mm stamlösning av STS i DMSO. Använd den fuktspridande metod som beskrivs i steg 4,6 för att byta media.
2. Nu upprepar vi steg 5,2-5,6 för senare tidpunkter. Vi upprepar denna process tills experimentet är klar.
3. Under experimentet kommer fler medelstora behöva läggas så att provet inte uttorka. Detta sker genom att pipettera mediet in i skogsdungen i cellen plattan utan att ta bort från scenen och utan att störa FOV.

7. Representativa resultat

Vid slutet av försöket, kommer de insamlade uppgifterna omfattar ett stort antal av filtrerade bilder som måste bearbetas för att extrahera subcellulära strukturella data. Två exempel visas för ett optiskt filter bank bestående av 9 Gabor-liknande filter med filter perioden S = 0.95μm, Gaussisk kuvert standardavvikelse s = S / 2 = 0.45μm, och riktlinjer Φ = 0 ° till Φ = 160 ° i 20 ° steg. (Se även [1] för mer information).

Exempel 1: Marine Diatom

Vi ansökte först vår orientering känsliga filter bank till en marina kiselalger prov (Carolina Biological Supply Company) med orienterade funktioner som var klart synliga på mörka fält (DF) imaging (bild 1). Den optiskt filtrerade bilderna visas tillsammans med ofiltrerad bild av provet för jämförelse.

Figur 1: Mörkt fält (DF) och optiskt filtrerad bild av marina kiselalger. Vi kommer att analysera kiselalger i det nedre högra hörnet av bilden (vita pilen i den vänstra mest panelen).

Uppsättningen av nio Gabor-filtrerade bilder av kiselalger behandlades pixel-för-pixel för objektorientering och rundhet. Behandling bestod av (1) summering mäts svar på alla nio Gabor-filtrerad bilder på varje pixel för att fastställa den totala omfattningen av signalen svaret därmed kodning respons betydelse, och (2) hitta Gabor filtret orientering, Φ, där svaret är maximerad och med förhållandet mellan denna maximal svar på det genomsnittliga utslaget för alla vinklar därmed kodning i vilken utsträckning föremål på varje pixel har en önskad orientering. Graden av orientering är nära besläktad med den geometriska proportioner av partikeln. I figur. 2B, the samlade respons pixeln till filtret banken (parameter 1) och graden av läggning eller aspect ratio (parameter 2) är kodade i färgmättnad och nyans, respektive. Ett bildförhållande nära 1 (blå) finns i områden där det inte finns något att föredra svar vinkel, medan högre värden (röd) indikerar områden där en högre önskad vinkel svar är närvarande. Underkonstruktion partikel orientering är kodad i ett koger tomt (Fig. 2C), där varje rad nära överens med den underliggande lokala objektorientering synas i ofiltrerade mörka fält (Fig. 2A).

Figur 2: A: Dark fält bild av kiselalger. B: Objektorientering bild. Färgskala visar grad av orientering (bildformat) medan ljusstyrkan kodar betydelsen av den totala Gabor filtret svar. C: Orientering av objekt med svar intensitet ≥ 10% av max. Linjesegment visar motsvarande struktur långa axel.

Exempel 2: apoptotiska celler

Här visar vi filtrerade bilder av nötkreatur endotelceller behandlas med staurosporine (STS) som bearbetades på samma sätt som kiselalger. Fig.. 3 visar en ofiltrerad mörka fält (DF) bild av cellerna tillsammans med det filtrerade nio bilder vid tidpunkten T =- 180 min. före STS behandling.

Figur 3: Mörkt fält (DF) och optiskt filtreras bilder av ett fält som innehåller flera levande endotelceller.

Den filtrerade bilderna senare förvärvades var 20 minuter för en tid av tre timmar efter STS behandling. Fig.. 4a visar en karta bildförhållande av cellerna som en funktion av tiden. I detta fall färgton representerar graden av orientering (märkt orientedness) som för färgton i bild. 2b ovan. Var dock bildformat ljusstyrkan inte viktade genomsnittet filtret svar. Genom att registrera våra kartor bildförhållande med fluorescens bilder av den märkta mitokondrier i cellerna (Fig. 4b), bestämd vi att den uppmätta bildförhållandet nedgång var begränsad till den cellulära regioner som innehåller mitokondrier och var samtidigt med mitokondrie-fragmentering som kunde observeras direkt i fluorescens bilder av samma celler. Fig.. 5 visar tid tomter som beskriver förändringen i bildförhållande som en funktion av tiden i celler som genomgår apoptos. Inom varje cell finns en nedgång i bildformat vid T = 6-10 min i de regioner som registret med fluorescerande mitokondrier, men inte i regioner som registrerar sig hos dim bakgrundsfluorescens områden.

Figur 4: Aspect ratio (a) och fluorescens (b) Bilder av endotelceller som behandlades med apoptosframkallande, staurosporine.

Figur 5: Tid tomter jämföra minskade partikel bildförhållandet (orientedness) i endotelceller behandlas med staurosporine. De enskilda spåren representerar tid tomter i enstaka celler. Nedgången i orientedness är begränsad till de regioner i de celler som registrerar med fluorescerande mitokondrier (till vänster) och är frånvarande från de återstående bakgrundsfluorescens regioner (högra panelen).

Nu när vi har bestämt att bildformat droppe motsvarar mitokondriella fragmentering, kan vi inducera apoptos i dessa celler, mäta fragmentering använda vår optiska spridningen metod utan att märka celler, och studera effekten av olika genetiska och experimentella förhållanden på detta dynamisk.

Discussion

Metoden som beskrivs ovan ger morfometriska kartor över de objekt som kan koda partikelstorlek eller orientering till exempel. Denna strukturella informationen kan användas på flera sätt:

1. Den kan användas som en första skärmen för att identifiera vävnaden eller cellen regioner som förändras under en viss behandling och sedan ytterligare analysera dessa regioner med särskilda molekylära och biokemiska analyser.
2. Den kan användas i kombination med fluorescens att ge en multimodal analys av de celler som kombinerar en samtidig förståelse av molekylära aktivitet (genom fluorescens) med kvantitativ karaktärisering av subcellulära struktur (med denna metod).
3. Om särskilda strukturerade åtgärder är korrelerad med en specifik organellar aktivitet i en viss biologisk process (t.ex. apoptos) kan metoden användas utan fluorescens etiketter skärm för olika genetiska och experimentella förhållanden som påverkar denna strukturella svar.

Hittills har vi visat att metoden är känslig för skillnader i partikelstorlek på i storleksordningen 30-50nm [2]. Vi har visat att metoden är känslig för förändringar i partikel orientering och bildförhållande [3] och till en minskning av partikel proportioner överensstämmer med apoptos-inducerad mitokondriella fragmentering (bild 4-5 ovan).

Resultaten av exempel 2 tyder på att vår metod tillåter dynamiska mätningar av cellulära funktion som kan tolkas i termer av specifika organellar funktion och som kan samlas in utan fluorescens etiketter eller exogena färgämnen. Emellertid var första validering av den uppmätta svaren mot särskild märkning organeller nödvändigt. När denna första validering är klar kan organellar dynamiken bli utforskad direkt med våra etikett-fri metod.

Tillämpning av metoden till flera cellulära villkor, och korrelera vår dynamiska strukturella mätning med placeringen av olika organeller i cellen, som vi gjorde han med mitokondrier, kan i slutändan leda till ett bibliotek av dynamiska strukturella beteenden som unikt kan karakterisera specifika cellulära stater ( t.ex. apoptos, oxidativ och metabolisk stress, inflammatorisk respons etc) .. Denna information kan ytterligare ingå i en "cell tillstånd analyzer", som kan användas i en mängd olika tillämpningar, inklusive nya läkemedel i klinisk cell analys.

Det är viktigt att notera att den metod som beskrivs här utgör en generell inriktning där optiska spridningen data som erhållits i en mikroskopisk avbildning kan användas för att extrahera specifika subcellulära dynamik. Däremot kan specifika instrument som används förbättras avsevärt. I synnerhet kan det nuvarande valet av Spatial Light Modulator för rumslig filtrering inte vara optimalt att maximera effektiviteten av datainsamling, spatial frekvens upplösning och optisk signal genomströmning. Kromatisk och geometriska avvikelser i samband med IT mikro-spegel enhet som används här diskuteras i [3]. Vi undersöker för närvarande de potentiella fördelarna och nackdelarna med en state-of-the-art anordning med flytande kristaller i stället för DMD att mildra dessa frågor. Dessutom, enheten för datainsamling är spatial filtrering och mikroskop kontroll aktiveras separat av mänskliga användare. Detta begränsar kraftigt förvärvet tid där ett stort antal av filtrerade bilder behöver samlas in före bearbetning. Således är automatisering av installationen största vikt att göra förvärvet tid i proportion till varaktigheten av CCD-exponering, som förväntas nå 10-tals millisekunder per filtrerade bilden för en tillräcklig signal-brus. Denna ökning av tidsmässig kommer också att ge oss möjlighet att mer exakt beskriva den strukturella dynamiken i organeller i levande celler. Vi arbetar därför aktivt med att utveckla ett anpassat grafiskt gränssnitt som kan förena kontrollen av hårdvaran och effektivisera aktivering av dess delar, inklusive mikroskop kontroll, CCD förvärv och optisk filtrering vid Spatial Light Modulator.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen		Low glucose DMEM
Liebowitz L15 medium	Invitrogen		Without phenol red
L-glutamine	Invitrogen
Mitotracker Green	Invitrogen
Bovine Brain Extract	Clonetics
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio Products
Heparin	Sigma-Aldrich
Staurosporine	Sigma-Aldrich
Dymethylsulfoxide	Sigma-Aldrich
Inverted microscope	Carl Zeiss, Inc.	Axiovert 200M
DMD	Texas Instruments	TI 0.7 XGA DMD 1100
CCD	Roper Scientific	Cascase 512B	High (16 bit) dynamic range CCD
CCD	Roper Scientific	Coolsnap cf