Summary
وصفنا تقنية لإعداد الخليط أوضح القشرية الإنسان ، وفصل البروتين SDS - PAGE ، واسترجاع مستضد immunoblotting مع الضد إلى الببتيد Aβ. باستخدام هذا البروتوكول ، ونحن باستمرار اكتشاف Aβ موحودي multimeric في الأنسجة والقشرية من البشر مع أمراض الزهايمر.
Abstract
للطي الشاذ والبلمرة من اميلويد β (Aβ) يعتقد الببتيد للشروع في تعاقب الاعصاب في التسبب بمرض الزهايمر
Protocol
الجزء 1 : إعداد الخليط الأنسجة توضيح
- Dounce التجانس الأنسجة القشرية غير المثبتة في حجم 4 مرات من الجليد الباردة العازلة (0.1M الفوسفات مخزنة المالحة [كا + + -- والمغنيسيوم + + خالية] زائد مثبط البروتياز 2X الكوكتيل [سانتا كروز]) مع ما يقرب من 30 جلدة مدقة حتى (العازلة إضافة أي 400μl ل100mg الأنسجة).
- تدور الخليط لمدة 5 دقائق على 3000 غرام (4 درجات مئوية). إزالة بعناية وأوضح supernatants aliquots تخزين هذه الخلاصات في -80 درجة مئوية حتى استخدام.
- تحديد تركيز البروتين الكلي (ميكروغرام / ميكرولتر) لتوضيح الخليط باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) مقايسة ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (ThermoFisher).
الجزء 2 : SDS - PAGE إعداد نموذج
- مع 10 أيضا ، 10-20 ٪ Tricine هلام (Invitrogen) ، وحجم الحد الأقصى الذي يمكن تحميله في البئر 25μl ~. ويشمل اجمالي حجم العينة SDS 2X العازلة و 10x وكيل الحد ، وبالتالي فإن الحد الأقصى لحجم جناسة أوضح أن يمكن تحميلها في البئر 10μl. أوضح 20 ٪ (ث / ت) ينبغي أن يكون الخليط القشرية تركيز البروتين الكلي أكبر من 5 ميكروغرام / ميكرولتر ، والسماح ل50μg البروتين الكلي لكل بئر. سوف عينات مع أقل من البروتين 5mg/ml تستلزم تحميل البروتين أقل مجموع لكل بئر. ومع ذلك ، ومستويات عالية من البروتين هي المثلى للكشف عن Aβ موحودي وتجميعها (50 60μg البروتين الكلي هو الأمثل).
تحميل دائما نفس الكمية من البروتين الكلي لكل بئر. - لكل جيل ، وتحميل واحد على الأقل بشكل جيد مع 10μl من علامة الوزن الجزيئي مثل Plus2 SeeBlue (Invitrogen). كعنصر تحكم إيجابية ، تشغيل 10 - 100ng الاصطناعية أو Aβ40 Aβ42 الببتيد (مخفف في 1xPBS) في مكان آخر أيضا.
- تحضير مخاليط رد فعل على الجليد ، وذلك باستخدام إذابة الطازجة ، أوضح الخليط. أنابيب لدوامة ثانية 50-10 ، والحرارة في حوض جاف على 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تدور بسرعة لإزالة جميع العينات التكثيف في الحد الأقصى.
الجزء 3 : SDS - PAGE الكهربائي جل
- تحميل عينات vortexed على جل Tricine 10-20 ٪ في Gelbox XCell قفل البسيطة سيل من المؤكد ، وذلك باستخدام Tricine SDS العازلة على التوالي ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen)
- تشغيل هلام في الجهد المستمر من 125V لمدة 90 دقيقة. اسمحوا عينات تستمر حتى الفرقة علامة 4KDa حوالي 1 سم من الجزء السفلي من هلام.
الجزء 4 : نقل البروتينات من الهلام إلى الأغشية
- إزالة المواد الهلامية بعناية من حالة من البلاستيك وتجميع ساندويتش نقل داخل وحدة لطخة XCell الثاني ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen). قبل النشاف الرطب منصات والأغشية العازلة مع النيتروسليلوز 0.2μm نقل تريس ، جليكاين (20 ٪ الميثانول) ، وإزالة أي فقاعات من منصات النشاف أو تصفية شطيرة الورق / الغشاء.
- في Gelbox XCell ، وملء الغرفة الداخلية العازلة مع نقل وملء الغرفة الخارجي مع DIH 2 O (التعرض الميثانول يمكن ارتداء أسفل gelbox البلاستيكية على مر الزمن).
- تشغيل ونقل لمدة 2-3 ساعات في التيار المستمر 25mA.
- عند اكتمال عملية النقل ، وتفكيك شطيرة وضع المواد الهلامية في DIH 2 O والأغشية في 1xPBS ، سواء في ساحة أطباق بتري بلاستيكية (أو حاوية أخرى مناسبة).
- لتصور كفاءة نقل البروتين ، يمكن ملطخة المواد الهلامية مع SafeStain الازرق ببساطة (Invitrogen) ، والأغشية مع الشقائقية S الأحمر وصمة عار (الدريتش سيغما) ، وكلاهما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وهذا لا يتعارض مع تلوين immunoblotting. إذا تلطيخ يكشف عدم كفاءة نقل البروتين ، وتعديل مدة نقل في الخطوة 3.
الجزء 5. مستضد حاتمة واسترجاع Immunoblotting
- استرجاع المستضد هو خطوة هامة في الكشف عن الحواتم Aβ على الغشاء للربط الأضداد خلال immunoblotting. أي باخرة ، الميكروويف ، أو ماء الاستحمام تحافظ على درجة حرارة ثابتة تبلغ 100 درجة مئوية وسوف يكون كافيا. لاسترجاع مستضد في باخرة ، والحرارة ختم الغشاء في الحقيبة الثقيلة من البلاستيك مملوءة Kapak 1xPBS ، في درجة حرارة الغرفة. وضع الحقيبة في شقة باخرة قبل ساخنة ، وبمجرد الحقيبة تبدأ في التوسع ، واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية. السماح لتبرد ببطء الغشاء قبل إزالته من الحقيبة ، لمنع التجاعيد المفرطة.
- في درجة حرارة الغرفة ، وإزالة الغشاء بعناية من الحقيبة تبخير وشطف الغشاء لمدة 5 دقائق في 1xPBS ، تليها شطف 5 دقائق في TBS - T (تريس مخزنة المالحة ، ودرجة الحموضة 8.0 مع 0.05 ٪ توين - 20 [سيغما] ) ، على شاكر المداري. احتضان الغشاء في محلول حظر (2.5 ٪ دهن الحليب في TBS - T) لمدة ساعة ، والهز. دون الشطف ، ونقل إلى غشاء صحن أو الحقيبة البلاستيكية التي تحتوي على الأجسام المضادة الأولية مخففة في حل حظر (6E10 في 1:1،000 [1μg/ml] 1:5،000 التخفيف [0.2μg/ml] ، كوفانس) ، فقاعة تجنبس. على احتضان شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة ثم 24-48 ساعة تهتز عند 4 درجات مئوية (أطول الحضانة قد يعطي إشارة أفضل).
- شطف الغشاء لمدة 30 دقيقة في TBS - T (واحد سريع شطف تليها 3 دقيقة يشطف X 10).
- احتضان الغشاء في HRP - مترافق الضد الثانوية (أمرشام ECL الأغنام المناهضة للماوس ، وجنرال الكتريك للرعاية الصحية) ، مخففة في 1:10،000 في حل حظر لمدة 90 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الغشاء لمدة 30 دقيقة في TBS - T (واحد سريع شطف تليها 3 دقيقة يشطف X 10).
- على شاكر ، في احتضان الغشاء طازجة من صنع كاشف الغربية SuperSignal Electrochemiluminescence بيكو (ThermoFisher) لمدة 5 دقائق ، وصمة عار قبالة كاشف الزائدة على الورق الخالي من الوبر ومكان تصفية الغشاء في شريط الفيلم ، وبين حماة ورقة من البلاستيك. وصمة عار قبالة إضافية SuperSignal كاشف مع الغبار خالية Kimwipes إذا لزم الأمر.
- يعرض الفيلم لكوداك MR Biomax لفترات من 30 ثانية تصل الى 30 دقيقة والتطور في تطوير الفيلم. بعد 5 دقائق ، على الأرجح أن عصابات مونومر Aβ تكون مشبعة.
- يمكن تجريد أغشية (بعد الشطف في TBS - T) التي تهتز في استعادة بلس تجريد العازلة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وreprobed مع الأضداد إضافية إذا لزم الأمر.
الجزء 6 : الممثل طخة مناعية :
ويتم تحليل الأرقام 1A - C. الخليط تحتوي على توضيح كيفية 50μg البروتين الكلي في الفترة من 7 بالكائن البشري لوجود Aβ multimeric وAPP. Immunoblotting مع 6E10 الضد يكشف مونومرات Aβ ، dimers ، trimers ، tetramers وAPP (عصابة أعلى) في جميع الحالات الزهايمر ، فضلا عن ارتفاع الوزن الجزيئي وفيرة Aβ multimers في حالات م 2. Aβ40 الاصطناعية تؤكد هوية الفرق انخفاض الوزن الجزيئي. م : مرض الزهايمر ، DLB : الخرف مع الهيئات ليوي ، ND : Nondemented الإنسان (أ) تعرض الفيلم لمدة 30 دقيقة ، و (ب) تعرض الفيلم 5 دقائق ، و (ج) 30 تعرض الفيلم الثاني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أهمية تجميع Aβ في التسبب في مرض الزهايمر 1،4،5 ، وقد وصفت دراسات قليلة كميا أو توزيع multimers Aβ متنوعة في عينات الأنسجة البشرية القشرية 2. المناعى التقنيات استخداما لا تسمح للتمييز من الأنواع المتميزة Aβ multimeric في الأنسجة القشرية الثابتة. الخليط غير المثبتة في الأنسجة القشرية ، ويمكن فصل multimers Aβ وتقييمها كيميائيا باستخدام هلام إستشراد وطرق الكشف عن الأجسام المضادة مقرا لها. ومع ذلك ، قد تكون مخفية الحواتم Aβ التي تستهدف الببتيد داخل هياكل مجمعة وتعديلها بعد translationally ، ومنع الكشف وتقدير دقيق للAβ المجمعة. استخدام الحرارة الناجمة عن مستضد حاتمة استرجاع جنبا إلى جنب مع SDS - PAGE وimmunoblotting مع الأجسام المضادة للمنطقة من محطة N - Aβ 6،7 ، ونحن قادرون على فصل وكشف طبيعيا multimers Aβ المعزولة من العقول البشرية. ويمكن عندئذ متميزة السكان multimer Aβ الخليط في الأنسجة التي يمكن قياسها كميا ، أوضح كثافة. بالإضافة إلى ذلك ، مزيج من هلام أو الاستخراج مع غشاء Aβ immunoblotting سيسمح لمزيد من توصيف الهيكلية التي تحدث بشكل طبيعي ، بعد تعديل translationally multimers Aβ من الأنسجة البشرية. سيكون من المهم تحديد ما إذا كان multimers Aβ في دماغ الإنسان هي SDS المقاوم ، أو إذا كانوا SDS - الحساسة وبالتالي كسر أسفل إلى أصغر المجاميع التي تمسخ SDS في ظل ظروف محددة. وتوصيف مختلف أشكال Aβ مجمعة في الدماغ البشري تسهيل البحث عن علاجات والمؤشرات الحيوية لمرض الزهايمر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
شكرا جزيلا لPranski الين وكارولين Suwyn للحصول على المساعدة التقنية الممتازة وهاري ليفين إلى الثالث ، M. بول ميرفي ، ومارلا التسخير لإجراء محادثات هامة. وقدم التمويل RR - 00165 ، PO1AG026423 ، P50AG025688 ، AG030539 ، ومؤسسة وودروف وجامعة إيموري جنة البحوث.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-29130 | 1 tablet in 25ml buffer |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 23225 | |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark | Invitrogen | EI0002 | |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) | Invitrogen | LC1676 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Invitrogen | NP0004 | |
| SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen | LC5925 | |
| Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well | Invitrogen | EC6625BOX | |
| Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size | Invitrogen | LC2000 | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Invitrogen | LC1675 | |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Invitrogen | LC3675 | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | Will not interfere with immunostaining |
| ATX Ponceau S Red staining solution | Sigma-Aldrich | 09276 | Will not interfere with immunostaining |
| Kapak heat sealable plastic sample pouches | Fisher Scientific | 0181225AA | |
| 6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) | Covance | SIG-39320 | Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) | GE Healthcare | NA931-1ML | Dilute at 1:10,000 |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34077 | |
| Kodak Biomax MR Film | Carestream Health | 870 1302 |
References
- Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
- Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
- Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
- Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
- Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
- Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
