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Neuroscience

SDS-PAGE/Immunoblot检测人脑皮层组织中的Aβ多聚匀浆使用抗原表位检索

doi: 10.3791/1916 Published: April 23, 2010

Summary

我们描述了一个准备的人脑皮层匀浆澄清,经SDS - PAGE分离蛋白,抗原修复,并与Aβ肽抗体免疫印迹技术。使用这个协议,我们一贯检测皮层组织与阿尔茨海默氏症的病理的人类单体和多聚体的Aβ。

Abstract

异常折叠和聚合的β-淀粉样蛋白(Aβ)肽被认为是启动在阿尔茨海默氏病的发病机制的神经退行性级联

Protocol

第1部分:澄清组织匀浆的制备

  1. Dounce均质4次冰冷的缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲生理盐水[钙+ + - 和镁+ + - 免费]加2个蛋白酶抑制剂的鸡尾酒[圣诞老人Cruz的])体积不固定的皮质组织约30甚至杵中风(即加入400μl缓冲100毫克组织)。
  2. 自旋匀浆为5分钟,在3000克(4℃)。小心取出-80澄清这些提取物的上清液和存储等分℃直至使用。
  3. 确定使用一个bicinchoninic酸(BCA)法澄清的匀浆总蛋白浓度(微克/微升),根据制造商的说明(ThermoFisher)。

第2部分:SDS - PAGE样品制备

  1. 10-20%甘氨酸凝胶(Invitrogen公司),可装载每口井的最大音量是一个10〜25μl。总成交量包括2X SDS样品缓冲液和10倍的还原剂,使每口井可装载的最大音量是澄清匀浆加入10μl。澄清20%(W / V)皮质匀浆应该有一个总蛋白浓度大于5微克/μL,让每孔50μg总蛋白。小于5mg/ml蛋白质样品,将需要装载总蛋白少,每口井。然而,高蛋白质水平检测单体和聚合的Aβ(50 -60μg总蛋白是最佳)的最佳选择。
    始终负载总蛋白相同的金额,每口井。
  2. 对于每个凝胶,负载至少SeeBlue Plus2(Invitrogen公司),如分子量,加入10μl。作为阳性对照,运行10 - 100ng合成Aβ40或Aβ42肽(1xPBS稀释)在另一口井。
  3. 准备上冰的反应混合物,使用刚刚解冻,澄清匀浆。 5-10秒的涡管,在干浴热在100 ° C,为5分钟,然后快速旋转所有的样本,以除去凝结在第。

第3部分:SDS - PAGE凝胶电泳

  1. 加载到在10-20%的甘氨酸凝胶XCell确保锁迷你细胞Gelbox涡旋样本,采用甘氨酸SDS电泳缓冲液,根据制造商的说明(Invitrogen公司),
  2. 运行在一个恒定的电压为125V约90分钟的凝胶。让样品的运行,直到4KDa标记带从凝胶底部约1厘米。

第4部分:将蛋白质从凝胶膜

  1. 小心取出凝胶和塑料外壳内XCell II印迹模块组装转移夹心,根据制造商的说明(Invitrogen公司)。预湿的印迹垫和0.2μm的硝酸纤维素膜,Tris -甘氨酸转移缓冲液(20%甲醇),并删除任何气泡从印迹垫或过滤纸/膜夹心。
  2. XCell Gelbox,填补内宅与传输缓冲区,并填写DIH 2 O(甲醇暴露可以穿塑料gelbox随着时间的推移)的外室。
  3. 运行在一个恒定的电流为25mA的2-3个小时的转移。
  4. 当传送完成后,解构三明治和凝胶进入DIH 2 O和膜放入1xPBS,无论是在方形塑料培养皿(或其他合适的容器) 。
  5. 为了可视化蛋白转移效率,凝胶可以染色只需蓝SafeStain(Invitrogen公司),并与丽春红红染色(西格玛Aldrich公司)的膜,无论是根据制造商的指示。这不会干预与免疫染色。如果染色揭示蛋白转移效率低下,修改在步骤3中的传输时间。

第5部分。抗原表位的检索和免疫印迹

  1. 抗原修复在免疫抗体结合膜在揭示Aβ的抗原表位的重要一步。任何蒸锅,微波炉,或水洗澡,保持一个恒定的温度为100 ° C将足以。抗原检索在蒸笼,热密封膜在重型Kapak与1xPBS塑料填充袋,在室温下。莱平在预先加热的蒸笼袋;邮袋后,开始扩大,孵育一个额外的15分钟。允许膜慢慢冷却之前,从袋,防止过度起皱。
  2. 在室温下,小心地取出热气腾腾的囊膜和冲洗1xPBS膜5分钟,其次是在TBS - T的5分钟冲洗(TRIS缓冲生理盐水,pH值8.0与0.05%Tween - 20的[适马] ),上轨道摇床。一小时孵育膜在封闭液(TBS - T的2.5%,脱脂牛奶),摇匀。如果不清洗,转印膜含有封闭液稀释的第一抗体(6E10 1:1,000 [1μg/ml1:5,000 [0.2μg/ml]稀释,Covance公司),避免泡沫的一盘菜或塑料袋第在室温下的轨道摇床孵育一小时,然后在4 ° C振荡(潜伏期较长,可能会提供更好的信号)。24-48小时
  3. 膜冲洗30分钟,在TBS - T(快速冲洗3 × 10分钟的冲洗)。
  4. 孵育膜HRP标记的第二抗体(羊抗鼠,Amersham公司的ECL GE医疗),在1:10,000在封闭液稀释为90分钟,在室温下振动筛,。
  5. 膜冲洗30分钟,在TBS - T(快速冲洗3 × 10分钟的冲洗)。
  6. 在摇床,孵育5分钟新鲜SuperSignal西碧电化学发光试剂(ThermoFisher)膜,无绒滤纸吸干多余的试剂,并在电影盒放置的膜,塑料板材保护之间。如有必要,无粉尘Kimwipes吸干额外的SuperSignal试剂。
  7. 暴露在柯达百玛士致辞片长达30分钟30秒的时间间隔,在电影开发和发展。 5分钟后,Aβ的单体带可能会饱和。
  8. 膜可剥离翻天覆地的还原,加上30分钟,在室温下剥离缓冲区和reprobed如果需要额外抗体(TBS - T冲洗后)。

第6部分:代表免疫印迹:

图1a
图1b
图1c
图1A - C。澄清的匀浆液,含有7人科目50μg总蛋白分析的多聚体的Aβ和APP的存在。免疫抗体6E10揭示Aβ的单体,二聚体,三聚体,四聚体,和应用程序在所有的老年痴呆症的情​​况下(顶部波段),以及丰富较高分子量在2例AD患者的Aβ多聚体。合成Aβ40证实低分子量乐队的身份。公元:阿尔茨海默氏症,DLB:Nondemented人类(一)30分钟的胶片曝光,(B)5分钟的胶片曝光,(C)30秒的胶片曝光:路易体,钕痴呆。

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Discussion

尽管Aβ聚集在阿尔茨海默氏病1,4,5的发病机制中的重要性,很少有研究描述或量化分配不同的Aβ多聚体在人脑皮层的组织样本2。常用的免疫组织化学技术不允许固定皮质组织中不同的多聚体的Aβ物种歧视。在不固定的皮质组织匀浆,Aβ的多聚体可以分离和生化评估使用凝胶电泳和抗体的检测方法。然而,有针对性的Aβ的抗原表位可能被隐藏在汇总和翻译后修饰的肽结构,防止聚集的Aβ检测和准确的定量。利用热诱导的抗原表位的检索,结合SDS - PAGE和6,7对Aβ的N -端区域的抗体免疫印迹,我们能够从人类大脑中分离的自然发生的Aβ多聚体分离和检测。不同澄清组织匀浆中的Aβmultimer种群,然后可以通过光密度量化。此外,凝胶或膜萃取相结合的Aβ免疫将使自然发生进一步的结构表征,翻译后修饰的Aβ多聚体从人体组织。这将是重要的,以确定是否在人类大脑中的Aβ多聚体SDS耐,或者如果他们SDS敏感,因此破碎成更小的聚集体,在规定条件下通过SDS变性。聚集的Aβ在人类大脑的形式多样的特性,将有助于为阿尔茨海默氏病的治疗和生物标志物的搜索。

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Acknowledgments

伊莱恩Pranski优秀的技术援助和卡罗琳Suwyn和哈里列文三,M.保罗墨菲,重要谈话和Marla杠杆许多感谢。 RR - 00165,PO1AG026423,P50AG025688,AG030539,伍德拉夫基金会和埃默里大学研究委员会提供了资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-29130 1 tablet in 25ml buffer
BCA Protein Assay kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) Invitrogen LC1676
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) Invitrogen NP0004
SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard Invitrogen LC5925
Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well Invitrogen EC6625BOX
Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size Invitrogen LC2000
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Invitrogen LC1675
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Invitrogen LC3675
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 Will not interfere with immunostaining
ATX Ponceau S Red staining solution Sigma-Aldrich 09276 Will not interfere with immunostaining
Kapak heat sealable plastic sample pouches Fisher Scientific 0181225AA
6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) Covance SIG-39320 Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Dilute at 1:10,000
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 34077
Kodak Biomax MR Film Carestream Health 870 1302

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References

  1. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
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  7. Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
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Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).More

Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).

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