Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

SDS-PAGE/Immunoblot Обнаружение Ар мультимеров в населенных корковой ткани гомогенатах использованием антиген-эпитопов поиска

doi: 10.3791/1916 Published: April 23, 2010

Summary

Мы опишем технику для подготовки уточнил человека корковых гомогенатов разделения белков с помощью ДСН-ПААГ, антиген поиска и иммуноблоттинга с антителами к Ар пептида. Используя этот протокол, мы последовательно обнаружить мономерные и многомерные Ар в ткань коры головного мозга у людей с патологией Альцгеймера.

Abstract

Аномальных складывания и полимеризации β-амилоида (Ар) пептид, как полагают, инициировать нейродегенеративные каскада в патогенезе болезни Альцгеймера

Protocol

Часть 1: Подготовка уточнил гомогената ткани

  1. Dounce гомогенизации незаписанных корковой ткани в 4 раза объема ледяного буфера (0,1 М фосфатным буферным раствором [Са + + - и Mg + +-Free] плюс протеазы 2x ингибитор коктейль [Санта-Крус]) с примерно 30 даже пестиком штрихов (т.е. добавить 400μl буфер до 100 мг ткани).
  2. Спиновые гомогенатах течение 5 минут при 3000 г (4 ° С). Осторожно снимите уточнил супернатанты и хранить аликвоты этих экстрактов при -80 ° C до использования.
  3. Определите общую концентрацию белка (мкг / мкл) для уточнил гомогенатах использованием bicinchoninic кислоты (ДСС) анализ, в соответствии с инструкциями производителя (ThermoFisher).

Часть 2: SDS-PAGE Пробоподготовка

  1. С 10 хорошо, 10-20% Tricine гель (Invitrogen), максимальный объем, который может быть загружен на одну скважину составляет ~ 25 мкл. Общий объем включает 2x образец SDS буфера и 10x восстановителем, поэтому максимальный объем гомогената уточнил, которые могут быть загружены в скважину 10 мкл. Разъяснено 20% (м / о) корковых гомогенатах должны иметь общую концентрацию белка более 5 мкг / мкл, что позволяет 50 мкг общего белка на лунку. Образцы с менее 5mg/ml белка потребует загрузки меньше общего белка на лунку. Однако высокий уровень белка являются оптимальными для обнаружения мономерных и агрегированных Ар (50-60μg суммарного белка оптимально).
    Всегда загружайте же количество общего белка на лунку.
  2. Для каждого гель, загрузить по крайней мере одну скважину с 10 мкл из маркер молекулярного веса, таких как SeeBlue Plus2 (Invitrogen). В качестве положительного контроля, запустить 10-100ng синтетических Aβ40 или Aβ42 пептид (разводится в 1xPBS) в другом хорошо.
  3. Подготовка реакционной смеси на льду, используя только что оттаяли, уточнил гомогенатах. Вихревые трубки в течение 5-10 секунд, тепло в сухой ванне при температуре 100 ° С в течение 5 минут, затем быстро спина все образцы для удаления конденсата в шапку.

Часть 3: SDS-PAGE гель-электрофореза

  1. Нагрузка встряхивали образцы на 10-20% Tricine геля в XCell Конечно Блокировка Мини-Cell Gelbox, используя Tricine SDS работает буфер, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen),
  2. Выполнить гель при постоянном напряжении 125 В в течение приблизительно 90 минут. Давайте образцы продлится до 4KDa группы маркера составляет около 1 см от нижней части геля.

Часть 4: Перенос белков из Гели для мембран

  1. Осторожно снимите гели из пластикового корпуса и монтаж сэндвич передачи внутри модуля XCell II Blot, в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen). Предварительно мокрой промокательной колодки и 0,2 мкм мембран нитроцеллюлозы с Трис-Глицин буфера передачи (20% метанола), и удалить все пузырьки из промокательной колодки или фильтровальную бумагу / мембранного сэндвича.
  2. В XCell Gelbox, заполнить внутреннюю камеру с передачей буфера и заполнить внешнюю камеру с DIH 2 O (метанол воздействия могут износиться пластиковые gelbox во времени).
  3. Выполнить перенос в течение 2-3 часов при постоянной силе тока 25 мА в.
  4. Когда передача завершена, деконструировать бутерброд и место гели в DIH 2 O и мембран в 1xPBS, как в квадратные пластиковые чашки Петри (или другой подходящий контейнер).
  5. Для визуализации эффективности белка-переносчика, гели могут быть окрашены с Simply Blue SafeStain (Invitrogen) и мембран с Красным пятном пунцовый S (Sigma Aldrich), и в соответствии с инструкциями производителя. Это окрашивание не будет вмешиваться в иммуноблоттинга. Если окрашивание выявляет неэффективные белка-переносчика, изменить время передачи в шаге 3.

Часть 5. Антиген-эпитопа поиска и Иммуноблоттинг

  1. Антиген поиска является важным шагом в выявлении Ар эпитопов на мембраны для связывания антител в течение иммуноблоттинга. Любой пароход, микроволновая печь, или водяной бане, который поддерживает постоянную температуру 100 ° C будет достаточно. Для поиска в антиген пароход рулонн мембраны в тяжелых Kapak пластиковый пакет заполнен 1xPBS, при комнатной температуре. Положите мешочек квартиру в предварительно нагретой пароход, однажды мешок начинает расширяться, инкубировать еще 15 минут. Разрешить мембраны медленно охлаждаться до удаления его из сумки, чтобы предотвратить чрезмерное морщин.
  2. При комнатной температуре, тщательно удалить мембрану из пар мешочек и полоскать мембраны в течение 5 минут в 1xPBS, после 5-ти минутах промыть в TBS-T (Трис-буферном растворе, рН 8,0 с 0,05% Твин-20 [Sigma] ), на орбитальном шейкере. Инкубируйте мембраны в блокировании решения (2,5% обезжиренным молоком в TBS-T) в течение одного часа, встряхивая. Без промывки, передача мембраны блюдо или пластиковый пакет содержащие первичные антитела разбавляют в блокировании решения (6E10 на 1:1000 [1μg/ml] 1:5000 [0.2μg/ml] разбавления, Covance), избегая пузырейs. Инкубировать на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение одного часа, а затем через 24-48 часов тряски при 4 ° С (больше инкубационный может дать лучший сигнал).
  3. Промыть мембраны в течение 30 минут в TBS-T (один быстрое полоскание затем 3 х 10 полосканий минуту).
  4. Инкубируйте мембраны в HRP-сопряженных вторичные антитела (Amersham ECL овец антимышиным, GE Healthcare), растворенный в 1:10000 в блокировании решения, в течение 90 минут на шейкере при комнатной температуре.
  5. Промыть мембраны в течение 30 минут в TBS-T (один быстрое полоскание затем 3 х 10 полосканий минуту).
  6. В шейкер, инкубировать мембраны в свеже-Запад сделал SuperSignal Пико электрохемилюминесценции реагента (ThermoFisher) в течение 5 минут, промокните лишнюю реагента на безворсовой фильтровальную бумагу и поместите мембрану в фильме кассету, между пластиковой защиты листа. Пятно от дополнительных реагентов с SuperSignal пыли Kimwipes если это необходимо.
  7. Expose для Kodak фильм Биомакс MR за каждые 30 секунд до 30 минут и развиваться в фильме разработчика. Через 5 минут, Ар полосы мономера, вероятно, будет насыщенным.
  8. Мембраны могут быть удалены (после промывки в TBS-T) при встряхивании в Restore Plus зачистки буфера в течение 30 минут при комнатной температуре и reprobed с дополнительными антителами, при желании.

Часть 6: Представитель Вестернблот:

На рисунке 1а
На рисунке 1б
Рис 1в
Цифры 1а-с. Разъяснено гомогенатах содержащие 50 мкг общего белка с 7 человека в качестве субъекта анализируются на наличие мультимерные Ар и АЭС. Иммуноблоттинг с антителами 6E10 показывает Ар мономеров, димеров, тримеров, тетрамеров и APP (верхний диапазон) во всех случаях болезни Альцгеймера, а также обильные более высоким молекулярным весом Ар мультимеров в 2 случаях нашей эры. Синтетические Aβ40 подтверждает личность более низкой молекулярной полосы веса. AD: болезнь Альцгеймера, DLB: деменция с тельцами Леви, Н. Д.: Nondemented человека () 30 минутный фильм воздействия, (б) 5 минут фильма экспозиции, (с) 30 секундной экспозиции пленки..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Несмотря на важность Ар агрегации в патогенезе болезни Альцгеймера 1,4,5, мало исследований описаны или количественно распространения разнообразных Ар мультимеров в человеческих корковых образцы ткани 2. Обычно используемые методы иммуногистохимического не допускают дискриминации различных видов мультимерные Ар в основной корковой ткани. В незаписанных корковых гомогената ткани, Ар мультимеров могут быть отделены и биохимически оценивали с помощью гель-электрофореза и на основе антител методами обнаружения. Тем не менее, Ар эпитопов, которые ориентированы могут быть невидимыми в агрегированном и пост-трансляционно модифицированный пептид структуры, предотвращения обнаружения и точной количественной оценки агрегированных Ар. Использование тепла вызванных антиген-эпитопа поиска в сочетании с SDS-PAGE и иммуноблоттинг с антителами к N-концевой области Ар 6,7, мы можем разделить и обнаружить естественные Ар мультимеров изолированы от человеческого мозга. Отдельное Ар населения мультимера в уточнил гомогенатах ткани могут быть количественно с помощью денситометрии. Кроме того, сочетание геля или мембранной экстракции Ар иммуноблоттинга позволит дальнейшая структурная характеристика естественных, посттрансляционно изменение Ар мультимеров из человеческих тканей. Это будет иметь важное значение для определения Ар мультимеров в человеческом мозге SDS-стойкие, или, если они SDS-чувствительной и, следовательно, разбиваются на более мелкие агрегаты с помощью ДСН денатурации при определенных условиях. Характеристика различных форм агрегированных Ар в человеческий мозг будет способствовать поиску методов лечения и биомаркеров для болезни Альцгеймера.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Большое спасибо Элейн Pranski и Каролин Suwyn за отличную техническую помощь и Гарри LeVine III, М. Пол Мерфи, и Марла трансмиссии для важных разговоров. Финансирование было предоставлено RR-00165, PO1AG026423, P50AG025688, AG030539, Вудрафф Фонда и Университета Эмори исследовательского комитета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-29130 1 tablet in 25ml buffer
BCA Protein Assay kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23225
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Kit CE Mark Invitrogen EI0002
Novex Tricine SDS Sample Buffer (2X) Invitrogen LC1676
NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) Invitrogen NP0004
SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard Invitrogen LC5925
Novex 10-20% Tricine Gel 1.0 mm, 10 well Invitrogen EC6625BOX
Nitrocellulose membranes, 0.2 μm pore size Invitrogen LC2000
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) Invitrogen LC1675
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) Invitrogen LC3675
SimplyBlue SafeStain Invitrogen LC6060 Will not interfere with immunostaining
ATX Ponceau S Red staining solution Sigma-Aldrich 09276 Will not interfere with immunostaining
Kapak heat sealable plastic sample pouches Fisher Scientific 0181225AA
6E10 mouse monoclonal antibody to Aβ(1-16) Covance SIG-39320 Dilute 1:1,000 up to 1:5,000 for WB
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Aβ (from sheep) GE Healthcare NA931-1ML Dilute at 1:10,000
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Fisher Scientific, Inc. 34077
Kodak Biomax MR Film Carestream Health 870 1302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297, 353-356 (2002).
  2. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 101-112 (2007).
  3. Walker, L. C., LeVine, H. The cerebral proteopathies. Neurobiol. Aging. 21, 559-561 (2000).
  4. Selkoe, D. J. Aging, amyloid, and Alzheimer's disease: a perspective in honor. of Carl Cotman. Neurochem. Res. 28, 1705-1713 (2003).
  5. Walsh, D. M., Selkoe, D. J. Abeta oligomers - a decade of discovery. J. Neurochem. 101, 1172-1184 (2007).
  6. Swerdlow, P. S., Finley, D., Varshavsky, A. Enhancement of immunoblot sensitivity by heating of hydrated filters. Anal. Biochem. 156, 147-153 (1986).
  7. Ida, N., Hartmann, T., Pantel, J., Schröder, J., Zerfass, R., Förstl, H., Sandbrink, R., Masters, C. L., Beyreuther, K. Analysis of hetergeneous A4 peptides in human cerebrospinal fuid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay. J. Biol. Chem. 271, 22908-22914 (1996).
SDS-PAGE/Immunoblot Обнаружение Ар мультимеров в населенных корковой ткани гомогенатах использованием антиген-эпитопов поиска
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).More

Rosen, R. F., Tomidokoro, Y., Ghiso, J. A., Walker, L. C. SDS-PAGE/Immunoblot Detection of Aβ Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval. J. Vis. Exp. (38), e1916, doi:10.3791/1916 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter