Линеаризация Анализ белка Брэдфорд

Summary

Точность и чувствительность определения белка путем быстрого и удобного анализа Брэдфорда, подрывается внутренней нелинейности. Мы показываем, простая процедура линеаризации, что существенно повышает точность, повышает чувствительность теста примерно в 10 раз, и значительно сокращает вмешательство моющих средств.

Abstract

Определение мкг количества белка в Брэдфорд Кумасси синий блестящий анализ выполняется путем измерения оптической плотности при 590 нм. Это наиболее распространенный тип анализа позволяет быстро и простых белков количественного в клеточных лизатов, клеточные фракции, или рекомбинантный белок образцы, с целью нормализации биохимических показателей. Тем не менее, внутренняя нелинейность компромиссы чувствительность и точность этого метода. Показано, что при стандартных условиях теста, отношение поглощения измерения при 590 нм и 450 нм строго линейна концентрации белка. Эта простая процедура повышает точность и улучшает чувствительность теста примерно в 10 раз, что позволяет количественное до 50 нг бычьего сывороточного альбумина. Кроме того, вмешательство обычно введены моющие средства, которые используются для создания клеточных лизатов значительно снижается по новому протоколу. Линейное уравнение разработан на основе действующих масс и закон Бера идеально подходит экспериментальных данных.

Protocol

Линеаризация Калибровочный график белка Брэдфорд:

Кумасси бриллиантовый синий анализа белка, широко известный как анализ Брэдфорд ^1, широко используется из-за его быстрого и удобного протокола, а также его относительной чувствительности. К сожалению, в значительной степени кривизны в широком диапазоне концентраций белка (рис. 1). Таким образом, только узкий круг относительно высокой концентрацией белка, 2-10 мг / мл BSA, используется для калибровки графика, который затем лучше соответствует линейной регрессии (рис. 1, зеленый). Тем не менее, нелинейности требует концентрации белка неизвестных образцов, чтобы подпадать под ограниченный круг калибровочный график для того, чтобы избежать большой ошибки, и это также снижает точность в пределах ограниченного диапазона. Нелинейности представляет серьезную проблему, в частности, когда мкг количества белка не доступны, и это часто требует нескольких разведений неизвестных образцов.

Как отмечается в оригинальной статье Брэдфорд, "источником нелинейности в реагент себя так как перекрытия в спектре двух различных формах цвет красителя." ^1. На самом деле, три формы красителя Кумасси бриллиантовый синий находятся в кислотно-щелочного равновесия в кислую обычной рН анализа ^2. Красный, синий, и зеленый формы имеют максимумы поглощения при 470, 590 и 650 нм соответственно (рис. 2). Синий форму, которая связывает белки, образуя комплекс, интенсивно поглощает свет в 594 нм ^{3, 4} (рис. 2). Брэдфорд также отметил, что "фоновое значение для реагентов непрерывно уменьшается по мере красителем связывается с белком" ¹ (рис. 3). Таким образом, мы попытались рассчитать сокращение 590 нм фоне, как увеличение количества белка добавляют, измеряя изменения поглощения при 450 нм, где белок-краситель комплекс не впитывает. Мы обнаружили, что уменьшение фона частично, но не полностью, объясняет нелинейность (рис. 4).

Затем мы предположили, что снижение свободной концентрации красителя производит другой искажения линейного отклика, потому что, как белка-связывание красителя находится в равновесии, ^5, образование комплекса зависит не только от концентрации свободного белка, но и на том, что свободного красителя (рис. 5). Принимая во внимание как вопросам, связанным с переменной концентрации свободного красителя, мы разработали математические уравнения, описывающего линейную зависимость между концентрацией белка и отношением абсорбции измерений, 590 нм более чем 450 нм (рис. 6). Подробное описание теоретических и экспериментальных исследований можно найти в нашей публикации в 1996 Аналитический биохимии ^6. Математическое уравнение было экспериментально проверено и признано выход линейной калибровочной кривой по всей белка концентрации диапазоне (рис. 7). Кроме того, уравнения была проверена также независимое определение правильного зависит от рН значение Y-ось перехватить ^6.

Подробная Протокол Улучшенный Анализ белка Брэдфорд, используя микропланшетного Поглощение:

1. Подготовка 0,1 мг / мл исходного раствора стандарта бычий сывороточный альбумин. Любой другой стандарт может быть выбран, но отмечают, что же стандарт должен быть использован во всех экспериментах.
2. Развести неизвестных образцов в деионизованной воде. Стремитесь 5-50 мкг / мл. Тем не менее, более высокие или более низкие концентрации белка являются приемлемыми, так как нет никакого предела для линейного диапазона анализа. Тем не менее, измерение должно быть в пределах линейного диапазона поглощения читателя.
3. Развести реагент Брэдфорд (Bio-Rad) в 2,5 раза в деионизованной воде.
4. Добавить 0 и 10-50 мкл BSA фондовом решение трех экземплярах скважин (создание 0-5 мкг БСА калибровочной кривой). Дополнение деионизированной водой до 100 мкл / лунку.
5. В разных скважин, добавьте 100 мкл образца в неизвестном трем образцам. Несколько концентрации неизвестного образца может быть использована для повышения точности.
6. Добавить 100 мкл разбавленного реагента Брэдфорд всех лунок. Общий объем составляет 200 мкл / лунку.
7. Подождите не менее 5 мин, но не более 60 мин для цветных развития.
8. Пустые должно быть 200 мкл деионизованной воды (и не нулевой краситель белка хорошо).
9. Измерить абсорбцию при 590 нм и 450 нм.
10. Подготовка калибровочный график путем деления чистой стоимости поглощения при 590 нм и 450 нм. Обратите внимание, что нулевой белка (краситель только) значение должно быть включено в качестве точки данных (рис. 8).
11. Рассчитайте концентрацию неизвестного образца на основе линейного уравнения калибровочной кривой (рис. 9).

Представитель Результаты:

В отличие от оптической плотности при одной длине волны 590 нм, соотношение значения абсорбции, 590 нм более чем 450 нм, линейная Wй концентрации белка (рис. 10).

Концентрация белка неизвестного образца может быть просто рассчитывается с использованием линейного уравнения калибровочной кривой (рис. 10, уравнения).

Однако, повышенная точность получается размером в несколько неизвестных разведения образца. С этой целью подготовить два графика. Первый калибровочный график для стандартной мкг белка на оси Х (рис. 11, справа). Второй график для неизвестного образца, с мкл оригинальные неразбавленного образца на оси Х (рис. 11, слева). Красителя только стоимость должна быть включена в оба графика (рис. 11). Концентрация белка неизвестного образца получают путем деления склоны неизвестного образца и стандарта (рис. 11, уравнения).

Рисунок 1. Обычных калибровки Брэдфорд графа. Линейный диапазон представлен зелеными символами.

Рисунок 2. Спектры белками красителя комплекса и красителя в одиночку.

Рисунок 3. Белково-красителя равновесия.

Рисунок 4. Сокращение правильный рассчитывается фоне частично уменьшает нелинейность.

Рисунок 5. Белково-красителя равновесия.

Рисунок 6. Математические основы для линеаризации анализа белка Брэдфорде.

Рисунок 7. Линеаризация график калибровки Брэдфорде.

Рисунок 8. Расчет значений абсорбции отношение.

Рисунок 9. Калибровку линейной Брэдфорд графа.

Рисунок 10. Линеаризация график калибровки Брэдфорде.

Рисунок 11. Неизвестного образца, концентрация расчета.

Discussion

Анализ Брэдфорд белок популярной благодаря своей простоте исполнения и относительной чувствительности. Линеаризация по всей концентрации белка предельных значений, полученных по протоколу, представленные здесь еще больше упрощает анализ, так как неизвестные образцы не нужно падать в пределах калибровочный график.

Важно отметить, что улучшение протокол также предусматривает следующие преимущества по сравнению с первоначальной Брэдфорд протокола:

1. Повышенная точность.
2. Чувствительность увеличивается примерно на порядок, что позволяет определить всего за 50 нг BSA в анализе микропланшета ^6.
3. Повышение чувствительности позволяет белка количественное в присутствии детергентов. С оригинальной Брэдфорд протокол, вмешательство со стороны моющие средства обычно используются для лизиса клеток часто приводят к уменьшилась ответ на белок. Улучшение чувствительности на порядок дает возможность разбавления образцов до точки, где вмешательство моющих средств исключается. Обратите внимание, что стандартные образцы должны содержать тот же состав моющих средств и концентрации, как в разбавленных неизвестных образцов.

Пиков поглощения белка красителем сложной и свободной форме красного красителя на 594 и 470 нм соответственно. Рекомендуется для измерения абсорбции при 590-600 нм, для достижения максимальной чувствительности к белку изменение концентрации, а при 450-485 нм, для обеспечения линеаризации.

Из-за оптического рассмотрения длина пути, более высокая точность может быть достигнута в 1 мл анализа кювет, где помещаются в регулярном спектрофотометр, а не микропланшетов читателя. В этом случае, наращивание масштабов объемах в 5 раз.

Это абсолютно обязательным, что деионизированной воды будет использоваться в качестве пустой. Линейной калибровочной кривой не может быть получено, если нулевой белка стандартных красителей, содержащий примеры используется как пустой.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford reagent	Bio-Rad	500-0006
Bovine Serum Albumin	Amersco	0332
Multiplate absorbance reader	BioTek	Synergy2