Summary
और तेजी से और सुविधाजनक ब्रैडफोर्ड परख द्वारा प्रोटीन दृढ़ संकल्प की सटीकता संवेदनशीलता आंतरिक nonlinearity से समझौता किया है. हम एक सरल linearization प्रक्रिया है कि बहुत सटीकता बढ़ जाती है, 10 गुना के बारे में परख की संवेदनशीलता में सुधार है, और काफी डिटर्जेंट द्वारा हस्तक्षेप कम कर देता है दिखाते हैं.
Abstract
माइक्रोग्राम ब्रैडफोर्ड Coomassie शानदार नीले परख में प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण absorbance के 590 एनएम पर माप के द्वारा पूरा किया है. यह सबसे आम परख जैव रासायनिक माप के सामान्यीकरण के प्रयोजन के लिए तेजी से और सरल सेल lysates, सेलुलर भिन्न, या पुनः संयोजक प्रोटीन के नमूने में प्रोटीन की मात्रा का ठहराव, सक्षम बनाता है. हालांकि, एक आंतरिक nonlinearity और इस विधि की संवेदनशीलता और सटीकता समझौता. यह दिखाया गया है कि मानक परख की शर्तों के तहत, 590 एनएम पर absorbance के मापन और 450 एनएम के अनुपात प्रोटीन एकाग्रता के साथ कड़ाई से रैखिक है. इस सरल प्रक्रिया सटीकता बढ़ जाती है और 10 गुना, अनुमति गोजातीय सीरम albumin 50 एनजी नीचे मात्रा का ठहराव के बारे में परख की संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है. इसके अलावा, आमतौर पर डिटर्जेंट कि सेल lysates बनाने के लिए उपयोग किया जाता है के द्वारा शुरू हस्तक्षेप बहुत नया प्रोटोकॉल से कम है. एक बड़े पैमाने पर कार्रवाई और बीयर कानून के आधार पर विकसित रेखीय समीकरण पूरी तरह से प्रयोगात्मक डेटा फिट बैठता है.
Protocol
ब्रैडफोर्ड प्रोटीन अंशांकन ग्राफ़ के linearization:
अपनी तेजी और सुविधाजनक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उसके रिश्तेदार संवेदनशीलता प्रोटोकॉल की वजह से Coomassie शानदार नीले प्रोटीन परख, सामान्यतः ब्रैडफोर्ड परख 1 के रूप में जाना जाता है, व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है. दुर्भाग्य से, वहाँ प्रोटीन सांद्रता का एक व्यापक रेंज (1 छवि) पर वक्रता की एक बड़ी डिग्री है. इसलिए, केवल अपेक्षाकृत उच्च प्रोटीन सांद्रता, 2-10 मिलीग्राम / मिलीलीटर BSA, के एक संकीर्ण सीमा अंशांकन ग्राफ, जो तब बेहतर रेखीय प्रतिगमन फिट बैठता है (छवि 1, हरी) के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, nonlinearity अज्ञात नमूने के प्रोटीन एकाग्रता अंशांकन ग्राफ के सीमित रेंज के भीतर गिर करने के क्रम में एक बड़ी त्रुटि से बचने की आवश्यकता है, और यह भी सीमित रेंज के भीतर सटीकता को कम कर देता है है. nonlinearity के विशेष रूप में एक गंभीर समस्या है जब प्रोटीन की मात्रा माइक्रोग्राम उपलब्ध नहीं हैं प्रस्तुत करता है, और यह अक्सर अज्ञात नमूने के कई dilutions की आवश्यकता है.
मूल ब्रैडफोर्ड समाचार पत्र में उल्लेख किया, "nonlinearity के स्रोत अभिकर्मक में ही बाद से वहाँ दो डाई के भिन्न रंग रूपों के स्पेक्ट्रम में एक ओवरलैप है." 1. वास्तव में, Coomassie प्रतिभाशाली नीले डाई के तीन रूपों 2 परख की सामान्य अम्लीय pH में एसिड आधार संतुलन में हैं. 470 पर, लाल, नीले, और हरे रंग रूपों absorbance मॅक्सिमा, 590, और 650 एनएम क्रमशः (छवि 2). नीले रंग के फार्म का है कि बांध प्रोटीन है, बनाने एक जटिल है कि तीव्रता में 594 एनएम 3, 4 (छवि 2) प्रकाश अवशोषण. ब्रैडफोर्ड यह भी कहा कि 1 (छवि 3) अभिकर्मक के लिए पृष्ठभूमि मूल्य लगातार के रूप में अधिक डाई प्रोटीन करने के लिए बाध्य है कम है ". इसलिए, हम 590 एनएम पृष्ठभूमि की कमी की गणना करने का प्रयास प्रोटीन मात्रा में वृद्धि के रूप में जोड़ रहे हैं 450 एनएम, जहां जटिल प्रोटीन - डाई को अवशोषित नहीं करता है absorbance के परिवर्तन को मापने के द्वारा. हमने पाया है कि आंशिक रूप से कम पृष्ठभूमि है, लेकिन पूरी तरह नहीं, nonlinearity (4 छवि) के लिए खातों.
हम तो धारणा है कि मुक्त डाई एकाग्रता में कमी रैखिक प्रतिक्रिया की एक और विरूपण उत्पादन, क्योंकि के रूप में प्रोटीन - डाई बंधन 5 संतुलन में है, जटिल गठन न केवल मुक्त प्रोटीन की एकाग्रता पर है, लेकिन यह भी मुक्त डाई की उस पर निर्भर करता है, (छवि 5). खाते में दोनों मुक्त डाई चर एकाग्रता से संबंधित मुद्दों को उठाते हुए, हम एक गणितीय समीकरण है कि प्रोटीन एकाग्रता और absorbance के माप, 450 एनएम (छवि 6) से अधिक 590 एनएम के अनुपात के बीच एक रैखिक संबंध का वर्णन विकसित की है. सैद्धांतिक और प्रायोगिक अध्ययन के एक विस्तृत वर्णन हमारे विश्लेषणात्मक जैव रसायन 6 में 1996 प्रकाशन में पाया जा सकता है. गणितीय समीकरण प्रयोगात्मक परीक्षण किया गया था और पूरे प्रोटीन सांद्रता रेंज (छवि 7) पर एक रेखीय अंशांकन वक्र उपज पाया. इसके अलावा, समीकरण भी Y-अक्ष अवरोधन 6 का सही मूल्य पीएच पर निर्भर एक स्वतंत्र दृढ़ संकल्प द्वारा मान्य किया गया था.
बेहतर ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल, एक Microplate absorbance रीडर का उपयोग:
- एक 0.1 मिलीग्राम / एमएल मानक, गोजातीय सीरम albumin का जायजा समाधान तैयार करें. कोई अन्य मानक चुना जा सकता है, लेकिन कृपया ध्यान दें कि एक ही मानक सभी प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
- विआयनीकृत जल में अज्ञात नमूने पतला. 5-50 μg / मिलीलीटर के लिए निशाना लगाओ. फिर भी, अधिक या कम प्रोटीन सांद्रता स्वीकार्य हैं, क्योंकि वहाँ परख के रैखिक श्रृंखला के लिए कोई स्पष्ट सीमा है. हालांकि, माप absorbance के पाठक के रैखिक सीमा के भीतर होना चाहिए.
- ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक (जैव रेड) विआयनीकृत जल में 2.5 गुना पतला है.
- 0 और BSA शेयर तीन प्रतियों कुओं (एक 0-5 μg BSA अंशांकन वक्र बनाने) समाधान के 10-50 μl जोड़ें. विआयनीकृत जल के साथ पूरक μl 100 तक पहुँचने / अच्छी तरह से.
- विभिन्न कुओं में, triplicates में अज्ञात नमूना के 100 μl जोड़ें. अज्ञात नमूने के कई सांद्रता सटीकता की वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सभी कुओं को पतला ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 100 μl जोड़ें. कुल मात्रा 200 μl / अच्छी तरह से है.
- कम से कम 5 मिनट है, लेकिन यह नहीं रंग के विकास के लिए अधिक से अधिक 60 मिनट रुको.
- खाली विआयनीकृत जल (और नहीं शून्य प्रोटीन अच्छी तरह से डाई) के 200 μl होना चाहिए.
- 590 एनएम और 450 एनएम absorbance के उपाय.
- 590 एनएम पर शुद्ध absorbance के मूल्यों को विभाजित करके और 450 एनएम पर एक अंशांकन ग्राफ तैयार करें. ध्यान दें कि शून्य प्रोटीन (केवल डाई) मूल्य डेटा बिंदु (छवि 8) के रूप में शामिल किया जाना चाहिए.
- अज्ञात अंशांकन वक्र (9 छवि) के रेखीय समीकरण के आधार पर नमूना की एकाग्रता की गणना.
प्रतिनिधि परिणाम:
590 एनएम के एकल तरंगदैर्ध्य, absorbance के मूल्यों, 450 एनएम पर 590 एनएम के अनुपात में absorbance के विपरीत, रैखिक w हैith प्रोटीन एकाग्रता (10 छवि).
अज्ञात नमूने के प्रोटीन एकाग्रता बस अंशांकन वक्र (10 छवि, समीकरण) के रेखीय समीकरण का उपयोग कर की गणना सकता है.
हालांकि, वृद्धि सटीकता कई अज्ञात नमूना dilutions को मापने के द्वारा प्राप्त की है. यह अंत करने के लिए, दो रेखांकन तैयार. पहले एक्स अक्ष (11 छवि, सही) पर μg प्रोटीन के साथ मानक के लिए एक अंशांकन ग्राफ है. दूसरा ग्राफ अज्ञात नमूना के लिए एक्स अक्ष (11 छवि, बाएं) पर मूल undiluted नमूना μl के साथ है. डाई केवल मूल्य दोनों रेखांकन में शामिल किया जाना चाहिए (11 छवि) है. अज्ञात नमूने के प्रोटीन एकाग्रता अज्ञात नमूना और मानक की ढलानों (11 छवि, समीकरण) विभाजित करके प्राप्त की है.
चित्रा 1 परम्परागत ब्रैडफोर्ड अंशांकन ग्राफ. रैखिक रेंज हरी प्रतीकों द्वारा प्रतिनिधित्व किया है.
चित्रा 2 जटिल प्रोटीन - डाई और डाई के अकेले स्पेक्ट्रा.
चित्रा 3. प्रोटीन डाई संतुलन.
चित्रा 4 सही गणना की पृष्ठभूमि की कमी nonlinearity आंशिक रूप से घट जाती है.
चित्रा 5 संतुलन प्रोटीन - डाई.
चित्रा 6 ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के linearization के लिए गणितीय आधार है.
7 चित्रा ब्रैडफोर्ड अंशांकन ग्राफ के linearization.
8 चित्रा absorbance के अनुपात मूल्यों की गणना.
9 चित्रा एक रैखिक ब्रैडफोर्ड अंशांकन ग्राफ.
10 चित्रा ब्रैडफोर्ड अंशांकन ग्राफ के linearization.
11 चित्रा अज्ञात नमूना एकाग्रता गणना.
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Discussion
ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख प्रदर्शन और रिश्तेदार संवेदनशीलता के अपने आसानी के कारण लोकप्रिय है. प्रोटोकॉल द्वारा प्राप्त रेंज पूरे प्रोटीन सांद्रता में linearization प्रस्तुत यहाँ आगे परख सरल है, के रूप में अज्ञात नमूने अंशांकन ग्राफ की सीमा के भीतर गिर करने की जरूरत नहीं है.
महत्वपूर्ण बात, सुधार प्रोटोकॉल आगे मूल ब्रैडफोर्ड प्रोटोकॉल पर निम्नलिखित लाभ प्रदान करता है:
- सटीकता की वृद्धि.
- संवेदनशीलता लगभग परिमाण के एक आदेश की वृद्धि हुई है, यह संभव के रूप में छोटा रूप में 50 microplate 6 परख में एनजी BSA निर्धारित करने के लिए बना.
- सुधार संवेदनशीलता डिटर्जेंट की उपस्थिति में प्रोटीन की मात्रा का ठहराव के लिए सक्षम बनाता है. मूल ब्रैडफोर्ड प्रोटोकॉल के साथ, आम तौर पर सेल lysis के लिए इस्तेमाल किया डिटर्जेंट द्वारा हस्तक्षेप अक्सर प्रोटीन के लिए एक कम जवाब में नतीजा होगा. परिमाण के एक आदेश द्वारा संवेदनशीलता के सुधार के नमूने के कमजोर पड़ने के लिए सक्षम बनाता है एक बिंदु है जहां डिटर्जेंट के हस्तक्षेप का सफाया कर दिया है. कृपया ध्यान दें कि मानक नमूने पतला अज्ञात नमूनों में के रूप में एक ही डिटर्जेंट संरचना और एकाग्रता को शामिल करना चाहिए.
जटिल प्रोटीन डाई और मुफ्त लाल रंग फार्म के absorbance चोटियों क्रमश: 594 और 470 एनएम पर हैं. यह 590-600 एनएम absorbance के उपाय, प्रोटीन एकाग्रता बदलने के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता को प्राप्त करने की सिफारिश की है, और 450-485 एनएम linearization सुनिश्चित करने के लिए.
ऑप्टिकल पथ लंबाई पर विचार करने के लिए कारण, एक 1 मिलीलीटर के बजाय एक microplate रीडर परख, जहां cuvettes एक नियमित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखा जाता है में उच्च सटीकता प्राप्त किया जा सकता है. उस मामले में 5 गुना मात्रा पैमाने अप.
यह बिल्कुल अनिवार्य है कि विआयनीकृत जल रिक्त रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. अगर शून्य प्रोटीन मानक डाई युक्त नमूना खाली के रूप में प्रयोग किया जाता है एक रेखीय अंशांकन वक्र प्राप्त नहीं किया जा सकता है.
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Acknowledgments
यह कागज देर से डा. ZVI Selinger, जो मूल यहाँ वर्णित अनुसंधान की मेजबानी की स्मृति को समर्पित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bovine Serum Albumin | Amersco | 0332 | |
| Multiplate absorbance reader | BioTek | Synergy2 |
References
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