Summary
ندلل على بروتوكول لتوليد اجنة الزرد خيالية للسلوك التصوير العيش الخلوية خلال مرحلة التطور الجنيني.
Abstract
تغيير الخلايا على نطاق واسع في مواقع وممتلكاتهم خلال مرحلة التطور الجنيني. وتنظم هذه التغييرات من التفاعلات بين الخلايا وبيئتها. أجنة خيالية ، والتي تتكون من خلايا جينية مختلفة عن الخلفية ، هي أدوات عظيمة لدراسة التفاعلات خلية خلية بوساطة الجينات في المصالح. شفافية الجنينية من الزرد في مراحل النمو المبكر تصاريح التصوير المباشر للالتشكل الأنسجة والأعضاء على المستوى الخلوي. هنا ، علينا أن نظهر بروتوكول لتوليد خيالية شبكية العين والدماغ في الأجنة الزرد والتصوير لأداء حية من خلايا المانحة. البروتوكول يشمل إعداد الإبر زرع ، وزرع GFP - معربا عن blastomeres المانحة لGFP سلبية المضيفين ، ودراسة سلوك الخلية المانحة تحت المجهر مبائر حية. مع تعديلات طفيفة ، ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة التطور الجنيني من الأنسجة والأجهزة الأخرى في الزرد. وتناقش أيضا مزايا استخدام GFP إلى الخلايا المانحة التسمية.
Protocol
اليوم 1. إعداد
1. إعداد الصلبان الأسماك
إعداد الصلبان البشرى من الزرد في المساء. لمنع التزاوج العشوائي قبل الوقت المطلوب ، استخدم فواصل لفصل الأسماك الإناث والذكور في أشرطة التزاوج. GFP - معربا عن الأسماك المعدلة وراثيا تستخدم كمصدر للblastomeres المانحة. خط pt104 المعدلة وراثيا (زو وآخرون ، 2008) ، وتستخدم هنا ، ويعرب عن GFP بتواجد مطلق تحت سيطرة المروج EF1. GFP التعبير يسمح التصور من الخلايا المانحة بواسطة التصوير الحي. ويمكن استخدام خطوط أخرى الأسماك المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية مناسبة لاحتياجات محددة.
2. إعداد شكل إسفين agarose الآبار للحصول على عقد الجنين
صب ذاب agarose 1 ٪ ، أعد البيض في الماء E3 (Westerfield ، 2007) ، في طبق بتري. تطفو في قالب من البلاستيك يحتوي على شكل نتوءات اسفين على حل agarose وترك حل agarose ترسيخ تماما. إزالة القالب بعناية ، وتزج السرير agarose بالماء E3.
3. إعداد زرع الإبر
استخدام الإبرة مجتذب العمودي (ديفيد KOPF صكوك) في إعداد القوة لجعل 11،5 الإبر عن طريق سحب الزجاج الماصات الشعرية (البنك آلات دقيقة). نصائح جيدة ينبغي أن إبرة تفتق مع اعمدة طويلة. طحن نصائح الإبرة بزاوية 45 درجة مع مطحنة مايكرو (Marishige) حتى فتحات مشطوف من 45μm - 40 في القطر الداخلي ويتم الحصول على (الشكل 1A). لتنظيف نصائح الإبرة ، ونعلق خرطوم إلى نهاية حادة من الإبرة ، وربط خرطوم لحقنة ، ومن ثم تمتص والافراج عن 10 ٪ من محلول حمض الهيدروفلوريك حتى يتم إزالة كافة الانقاض مرئية. المقبل ، وغسل بالماء المقطر نصائح ، تليها الإيثانول بنسبة 100 ٪. الهواء الجاف والإبر حتى يتبخر كل الايثانول. فمن المهم لضمان أن تكون جافة تماما نصائح : الإيثانول المتبقية سوف تدمر الإبر خلال تلميع خطوة من ارتفاع الحرارة. لتليين وتلميع حواف خشنة من النصائح الإبرة ، أخبز نصائح إبرة مع الحرارة المتولدة عن خيوط من مزور مايكرو (Marishige). لا تدع نصائح إبرة تلمس خيوط خلال التلميع. يمكن ضبط كمية الكهرباء المارة على الرغم من خيوط والمسافة بين خيوط وإبر نصائح لتحقيق الشروط المطلوبة للتدفئة. ينبغي أن لا تكون درجة الحرارة مرتفعة جدا : هذا سوف تذوب وتشوه نصائح الإبرة. بعد مملس حواف خشنة ، المس بعناية خيوط ساخنة مع طرف الإبرة ثم اسحب برفق بعيدا عن خيوط الإبرة لتوليد نهاية أشارت (1B الشكل). إبرة حادة ، ناعمة ، ونظيفة أمر بالغ الأهمية من أجل الحصول على blastomeres المانحة على حالها وعدم الإضرار الأجنة المضيفة.
4. يعد المسبار الجنين لتحديد المواقع
سحب ماصة الزجاج أكثر من لهب الغاز للحصول على الزجاج غرامة التحقيق مع نهاية مملس. وسيتم استخدام هذا التحقيق لوضع الأجنة في الاتجاه الصحيح قبل الزرع.
اليوم 2. قسيم أرومي زرع
1. جمع واجنة dechorionate
في اليوم التالي ، إزالة الفواصل في أشرطة عبر السماح الأسماك للتزاوج. وضع الأجنة في طبق بتري مملوءة بالماء E3. ثم والأجنة التي تمزق dechorionate يدويا بعيدا chorions من الأجنة مع زوج من ملقط الغرامة. استخدام ماصة الزجاج مع رمح عازمة على نقل الأجنة بعناية dechorionated في آبار agarose. تجنب أي اتصال من الأجنة مع الهواء ، مما يؤدي إلى انفجار الأجنة. السماح للأجنة في تطوير 28،5 درجة مئوية في الآبار agarose حتى 3 التسميد آخر ساعة ، أو HPF.
2. انشاء جهاز زرع
في حين أن الأجنة تطوير وانشاء جهاز الزرع من خلال ربط الإبرة إلى زرع الزيوت المعدنية المليئة النظام الجزئي الضخ. تأكد من أن النظام لا تسرب محاصرون وليس فقاعات الهواء في النظام. شغل الإبرة مرة زرع كامل مع الزيوت المعدنية ، باستثناء 0.5 -- في افتتاح غيض 1 ميكرولتر من الفضاء.
3. زرع blastomeres
لزرع blastomeres ، واستخدام الزجاج التحقيق لتحديد المواقع لتوجيه الجانب قسيم أرومي من أجنة 3 - 4 - HPF صعودا. ثم ، تضاف برفق الإبرة إلى زرع جنين المانحة وتمتص ببطء 50-20 blastomeres في الإبرة. ادخال الإبرة قسيم أرومي مملوءة إلى الجنين المضيف والافراج عن blastomeres ببطء. سيكون الموقع الذي يتم الإفراج عن التأثير فيها blastomeres ذريتها توطين في مراحل تنموية في وقت لاحق. لتحليل وضع شبكية العين والدماغ والخلايا الافراج في القطب الحيواني. خلال الزرع ، وتأكد من أن رأس الإبرة لا اتصال الهواء. لتقليل الأضرار الميكانيكية ، يجب ترك الأجنة المضيفة في الآبار في agarose 28.5 درجة مئوية حتى اليوم التالي. ثم ، رransfer الأجنة الفسيفساء إلى 24 لوحات جيدا قبل المغلفة مع 0.5 مل من agarose 1 ٪ ، مع جنين واحد في كل جانب. يضاف 1 مل من الماء إلى البيض E3 كل بئر. لمنع العدوى البكتيرية ، وإضافة 10 ميكرولتر من البنسلين والستربتوميسين 100X إلى الماء البيض E3.
اليوم 3. التضمين والتصوير المباشر للأجنة الفسيفساء
1. التضمين الأجنة
إعداد 1.5 ٪ نقطة انصهار منخفضة agarose (LMP) في الماء والحفاظ على بيضة E3 الحل في حمام الماء 30 درجة مئوية. نقل الجنين الى صحن فسيفساء نسيج الثقافة FluoroDish مع قاع كوب من سمك 0.17mm في (الآلات الدقيقة الدولي). إزالة المياه الزائدة E3 على مغادرة جنين المشمولة فقط من خلال الحد الأدنى من E3. إضافة 30-50 ميكرولتر ذاب LMP 1.5 ٪ إلى الجنين. الموقف بسرعة العين أو الدماغ أقرب إلى أسفل الزجاج ممكن قبل حل agarose يتصلب. بعد حل يبرد ، إضافة إضافية agarose حل لتأمين مزيد من الأجنة في المكان. ثم غمر طدت agarose مع كتلة 2-3 مل ماء بيضة E3.
2. مبائر التصوير
للفحص المجهري متحد البؤر ، يستخدم هدفا الغمر بالمياه المقلوب (أوليمبوس ، PlanApo ، 40 X/0.90 WLSM ، اليابان) مع التركيز عمق كبير. إضافة قطرة من الماء على الهدف والمكان بعد ذلك زراعة الأنسجة FluoroDish طبق على الهدف. صورة للتنمية ، نفذ الوقت الفاصل بين التصوير التي تلتقط صورا للأجنة كل 5 دقائق. اعتمادا على طبيعة التجارب ، ينبغي ضبط الفواصل الزمنية بين الطلقات.
ممثل النتائج
الشكل 2 يوضح ممثل HPF 24 الزرد الفسيفساء. GFP التعبير تسلط الضوء على الخلايا المانحة باللون الأخضر. الخلايا الظهارية العصبية للشبكية تغطي كامل سماكة الجدار في شبكية العين.
الفيلم يتناول تحركات خلايا المانحة في الدماغ المضيفة في 24 HPF. إشعار الخلايا morphologies تتغير بمرور الوقت.
الشكل 1. أشكال من النصائح إبرة الزرع. ألف وكان افتتاح مشطوف من غيض من إبرة خالية من الحطام بعد يغسل حمض الهيدروفلوريك. ولدت ألف باء وأشار في نهاية طرف الإبرة.
الشكل 2. التصور من GFP - معربا عن الخلايا المانحة في الأجنة الزرد خيالية في 24 HPF. اللوحة اليسرى يظهر إشارات GFP في الدماغ وشبكية العين. لوحة الوسطى هي صورة مشرقة من حقل الجنين. لوحة الحق يظهر صورة مدمجة.
الفيلم 1. تصوير الخلايا الحية GFP المانحة إيجابية أظهرت تغيرات واسعة في الخلايا الظهارية العصبية morphologies الدماغ أثناء التطور. وجمعت الأطر الفردية من الفيلم كل 5 دقائق بين 24 و 25 HPF. انقر هنا لمشاهدة الفيلم .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لزرع قسيم أرومي لتحليل وضع شبكية العين والدماغ في الزرد. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لتحليل تطور الأنسجة والأجهزة الأخرى عن طريق الإفراج عن ببساطة blastomeres المانحة إلى مواقع المناظرة في الأجنة المضيفة. وسم مع جزيئات GFP تعطي خلفية أنظف من العلامات مع ديكستران صبغ مترافق فلوري (هو وكين 1990). هذا لأن الحطام من الأصباغ ديكستران من خلايا ميتة المانحة يستمر لفترة أطول بكثير من GFP ، وبالتالي استنتاج مع التصوير (كاتالانو وآخرون ، 2007). إضافة إلى ذلك ، GFP إيجابية الخلايا المانحة هي أكثر صحة من تلك التي تحتوي على الأصباغ ديكستران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) كور غرانت (5P30EY008098) والصناديق التالية لXW : المعاهد الوطنية للصحة والبحوث R01EY016099 المنحة لمنع العمى جائزة التطوير المهني. نشكر اثروب كيرا للحصول على مساعدة في مجال التصوير مبائر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
|
|||
|
|||
|
|||
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
