Summary
Demonstreren we een protocol om chimere zebravis embryo's te genereren voor live-imaging cellulaire gedrag tijdens de embryogenese.
Abstract
Cellen veranderen uitgebreid in hun locaties en vastgoed tijdens de embryogenese. Deze veranderingen worden geregeld door de interacties tussen de cellen en hun omgeving. Chimère embryo's, die zijn samengesteld uit cellen van verschillende genetische achtergrond, zijn grote hulpmiddelen om de cel-cel interacties gemedieerd door genen van belang te bestuderen. De embryonale transparantie van de zebravis in vroege ontwikkelingsstadia maakt directe visualisatie van de morfogenese van weefsels en organen op cellulair niveau. Hier tonen we een protocol om chimerisch netvlies en de hersenen in zebravis embryo's te genereren en te leven beeldvorming van de donor cellen uit te voeren. Het protocol heeft betrekking op de voorbereiding van de transplantatie naalden, de transplantatie van GFP-expressie donor blastomeren om GFP-negatieve gastheren, en het onderzoek van de donor cel gedrag onder wonen confocale microscopie. Met lichte wijzigingen, kan dit protocol ook gebruikt worden om de embryonale ontwikkeling van andere weefsels en organen in de zebravis studie. De voordelen van het gebruik van GFP te labelen donor cellen worden ook besproken.
Protocol
Dag 1. Voorbereiding
1. Stel vis kruis
Stel paarsgewijze kruisingen van zebravis in de avond. Om te voorkomen dat willekeurige paring voor de gewenste tijd, gebruik verdelers om de mannelijke en vrouwelijke vissen in de paring cassettes te scheiden. GFP expressie transgene vis wordt gebruikt als een bron van donor blastomeren. De pt104 transgene lijn (Zou et al.., 2008), hier gebruikt, drukt GFP alomtegenwoordig onder de controle van de EF1 promotor. GFP expressie maakt visualisatie van de donor cellen door live-imaging. Andere transgene vis lijnen die geschikt zijn fluorescerende eiwitten te uiten kan worden gebruikt voor specifieke behoeften.
2. Bereid wigvormige agarose waterputten voor embryo houden
Giet gesmolten 1% agarose, opgesteld op E3 ei water (Westerfield, 2007), in een petrischaal. Float een plastic mal die wig-vormige uitsteeksels heeft op de agarose-oplossing en laat de agarose-oplossing volledig stollen. Verwijder voorzichtig de mal en dompel de agarose bed met E3 water.
3. Bereid transplantatie naalden
Gebruik een verticale Needle trekker (David KOPF Instruments) op te stellen vermogen 11,5 tot naalden te maken door te trekken glazen capillaire pipetten (World precisie-instrument). Goede tips naald moet conus met lange schachten. Maal de naald tips op een hoek van 45 graden met een Micro Grinder (Marishige) tot schuine openingen van 40-45μm in binnendiameter worden verkregen (Fig. 1A). Op te ruimen van de naald tips, voeg een slang aan het stompe uiteinde van de naald, sluit de slang aan op een spuit, en dan zuigen en laat een 10% fluorwaterstofzuur oplossing totdat alle zichtbare resten verwijderd is. Vervolgens maak ze schoon met gedestilleerd water, gevolgd door 100% ethanol. De lucht drogen de naalden totdat alle ethanol verdampt. Het is belangrijk ervoor te zorgen dat de tips volledig droog zijn: resterende ethanol zal de naalden ruïne in de hoge-temperatuur-polijsten stap. Te verzachten en polijsten van de ruwe randen van de naald tips, bak de naald tips met de warmte die door de gloeidraad van een Micro vervalser (Marishige). Laat niet de naald tips de gloeidraad aanraken tijdens het polijsten. De hoeveelheid elektriciteit die langs de gloeidraad en de afstand tussen het filament en de naald tips kan worden aangepast om de gewenste verwarming omstandigheden te bereiken. De temperatuur mag niet te hoog: dit zal smelten en vervormen de naald tips. Nadat de ruwe randen worden afgevlakt, voorzichtig raak de gloeidraad met de naald en dan zachtjes weg te trekken van de gloeidraad van de naald tot een puntig uiteinde (Fig. 1B) te genereren. Een scherpe, gladde en schone naald is van cruciaal belang voor het verkrijgen van intacte blastomeren donor en voor niet te beschadigen de host embryo's.
4. Bereid een embryo-positionering probe
Trek een glazen pipet boven een gasvlam tot een boete glazen sonde te verkrijgen met een gladgestreken einde. Deze sonde zal gebruikt worden om de embryo's positie in de juiste richting voorafgaand aan de transplantatie.
Dag 2. Blastomeer transplantatie
1. Verzamel en dechorionate embryo's
De volgende dag, verwijder de verdelers in het kruis cassettes te vissen laten om te paren. Plaats de embryo's in een petrischaal gevuld met water E3. Dan, dechorionate embryo's door handmatig te scheuren weg chorions van de embryo's met een paar fijne tang. Gebruik een glazen pipet met gebogen schacht zorgvuldig overdracht van de dechorionated embryo's in agarose putten. Vermijd elk contact van de embryo's met de lucht, die ervoor zorgen dat de embryo's te barsten. Laat de embryo's te ontwikkelen op 28,5 ° C in de agarose putten tot 3 uur na de bevruchting, of hpf.
2. Stel een transplantatie apparaat
Terwijl de embryo's ontwikkelen, het opzetten van een transplantatie apparaat door het aansluiten van de transplantatie naald om de minerale olie gevulde micro-pompsysteem. Zorg ervoor dat het systeem niet lekt en er geen luchtbellen gevangen zitten in het systeem. Terug in het volledige transplantatie naald met minerale olie, behalve de 0,5 tot 1 ul van de ruimte aan het uiteinde opening.
3. Transplantatie van blastomeren
Te verplanten blastomeren, gebruik dan een glas positionering sonde naar de blastomeer zijde van de 3-4-HPF embryo's naar boven te oriënteren. Dan, voorzichtig steek de transplantatie naald in een donor embryo en langzaam zuigen 50-20 blastomeren in de naald. Steek de blastomeer gevulde naald in een gastheer embryo en langzaam laat de blastomeren. De plaats waar de blastomeren worden vrijgegeven zal beïnvloeden, waar hun nakomelingen te lokaliseren in latere ontwikkelingsstadia. Aan het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen, laat cellen in het dier paal te analyseren. Tijdens de transplantatie, zorg ervoor dat de naald niet de lucht contact. Te minimaliseren mechanische beschadigingen, draagt de ontvangende embryo's worden achtergelaten in de agarose putten op 28,5 ° C tot de volgende dag. Dan, transfer het mozaïek embryo's tot 24-well platen pre-gecoat met 0,5 ml van 1% agarose, met een embryo in elk putje. 1 ml van de E3 ei water wordt toegevoegd aan elke well. Om te voorkomen dat bacteriële infecties, voeg 10 ul van 100X penicilline en streptomycine naar de E3 ei water.
Dag 3. Inbedding en live-beeldvorming van mozaïek embryo's
1. Inbedding embryo's
Bereid 1,5% laag smeltpunt agarose (LMP) in E3 ei water en houd de oplossing in een 30 ° C waterbad. Overdracht een mozaïek embryo tot een FluoroDish weefselkweek schotel met een glazen bodem van 0.17mm dikte (World precisie-instrumenten). Verwijder overtollig water op de E3 embryo enkel bedekt met een minimale hoeveelheid van de E3 te verlaten. Voeg 30-50 ul gesmolten 1,5% LMP naar het embryo. Al snel de positie van de ogen of de hersenen met betrekking tot de glazen bodem dicht mogelijk vóór de agarose-oplossing stolt. Nadat de oplossing afgekoeld, voeg extra agarose oplossing om verder te verzekeren van de embryo's in plaats. Dan dompel de gestolde agarose blok met 2-3 ml E3 ei water.
2. Confocale Imaging
Voor de confocale microscopie, is een water-immersie omgekeerde doelstelling (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japan) met grote nadruk diepte worden gebruikt. Een druppel water wordt toegevoegd aan de doelstelling en plaats dan een FluoroDish weefselkweek schotel op de doelstelling. Aan imago-ontwikkeling, uit te voeren time-lapse imaging door het nemen van foto's van de embryo's om de 5 minuten. Afhankelijk van de aard van de experimenten moeten de tijdsintervallen tussen de opnamen worden aangepast.
Representatieve resultaten
Figuur 2 illustreert een representatieve 24-hpf mozaïek zebravis. GFP expressie benadrukt de donor cellen in het groen. De retinale neuro-epitheliale cellen beslaat het hele dikte van de retinale muur.
De film toont de bewegingen van de donor cellen in de gastheer hersenen op 24 hpf. Merk op cellen morfologie de tijd veranderen.
Figuur 1. Vormen van de transplantatie naald tips. A. De schuine opening van de punt van een naald was vrij van vuil na fluorwaterstofzuur wasbeurten. B. Een puntige einde werd gemaakt aan de naaldtip.
Figuur 2. Visualisatie van GFP-expressie donor cellen in een chimère zebravis embryo's bij 24 hpf. Het linker paneel toont de GFP-signalen in de hersenen en netvlies. Het middelste paneel is een helder veld beeld van het embryo. Het rechter paneel toont de samengevoegde afbeelding.
Film 1. Live in beeld brengen van GFP positieve donor cellen aangetoond dat de omvangrijke veranderingen in de morfologie van de hersenen neuro-cellen tijdens de ontwikkeling. De afzonderlijke frames van de film werden verzameld om de 5 minuten tussen 24 en 25 hpf. Klik hier om de film te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video tonen we een methode voor blastomeer transplantatie in het netvlies en de ontwikkeling van de hersenen te analyseren in de zebravis. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de ontwikkeling van andere weefsels en organen te analyseren door simpelweg het vrijgeven van de donor blastomeren overeenkomstige plaatsen in de ontvangende embryo's. De etikettering met GFP moleculen levert een schonere achtergrond dan labeling met fluorescente kleurstof-geconjugeerde Dextran (Ho en Kane 1990). Dit komt omdat het puin van Dextraan kleurstoffen uit dode donor cellen duurt veel langer dan GFP, dus afleiden met beeldvorming (Catalano et al., 2007).. Daarnaast is het GFP-positieve donor cellen zijn gezonder dan die met Dextran kleurstoffen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door een National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) en de volgende middelen om XW: NIH Grant R01EY016099 en Onderzoek naar Blindness Career Development Award Prevent. Wij danken Kira Lathrop voor hulp bij confocale beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
|
|||
|
|||
|
|||
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
