Summary
Vi visar ett protokoll för att generera chimär zebrafisk embryon för Bildproduktion cellulära beteende under fosterutvecklingen.
Abstract
Cellerna ändras mycket i deras placering och egendom under fosterutvecklingen. Dessa förändringar regleras av samspelet mellan cellerna och deras omgivning. Chimär embryon, som består av celler med olika genetisk bakgrund, är bra verktyg för att studera cell-cell interaktioner gener av intresse. Den embryonala insyn i zebrafisk i tidiga utvecklingsstadier medger direkt visualisering av morfogenes av vävnader och organ på cellnivå. Här visar vi ett protokoll för att generera chimär näthinnor och hjärna i zebrafisk embryon och att spela live avbildning av givarens celler. Protokollet omfattar beredning av transplantation nålar, transplantation av GFP-uttryckande givare blastomerer att GFP-negativa värdar, och undersökning av givaren cellens beteende under Live konfokalmikroskopi. Med smärre ändringar, kan detta protokoll också användas för att studera embryonala utvecklingen av andra vävnader och organ i zebrafisk. Fördelarna med att använda GFP till celler etiketten donator diskuteras också.
Protocol
Dag 1. Förberedelser
1. Ställ in fisken kors
Ställ in parvisa korsningar av zebrafisk på kvällen. För att förhindra slumpmässig parning innan önskad tid, använd avdelare för att skilja kvinnliga och manliga fisk i parning kassetter. GFP-uttryckande transgena fisk används som en källa till givare blastomerer. Den pt104 transgena linjen (Zou et al., 2008), som används här uttrycker GFP ubiquitously under kontroll av de EF1 arrangören. GFP uttryck tillåter visualisering av givarens celler i levande bilder. Andra transgena fiskar linjer som uttrycker lämplig fluorescerande proteiner kan användas för specifika behov.
2. Förbered kilformade agarose brunnar för embryot att hålla
Häll smält 1% agaros, som utarbetats i E3 ägg vatten (Westerfield, 2007), i en petriskål. Float en plastform som har kilformade utskjutande delar på agaroslösningen och låt agaroslösningen helt stelna. Ta ut formen försiktigt och sänk ned agaros sängen med E3 vatten.
3. Förbered transplantation nålar
Använd en vertikal Needle avdragare (David Kopf instrument) vid effektläge 11,5 göra nålar genom att dra glas kapillärpipett (World precisionsinstrument). Bra nål tips bör kona med långa skaft. Slipa nålen tips på en 45-graders vinkel med en Micro Grinder (Marishige) tills avfasade öppningar 40-45μm i innerdiameter erhålls (Fig. 1A). Att rensa upp i nålen tips, bifoga en slang till den trubbiga änden av nålen genom att ansluta slangen till en spruta, och sedan suga upp och släppa en 10% vätefluoridsyrelösningar tills all synlig smuts tas bort. Därefter tvätta tips med destillerat vatten, följt av 100% etanol. Lufttorka nålar tills all etanol avdunstar. Det är viktigt att se till att tips är helt torra: kvarvarande etanol kommer att förstöra nålar under hög temperatur polering steg. Att mjuka upp och polera den grova kanter nålen tips, baka nålen tips med den värme som genereras av glödtråden i en Micro förfalskaren (Marishige). Låt inte nålen tips kontakt glödtråden vid polering. Den mängd el som passerar men glödtråden och avståndet mellan glödtråden och tips nålen kan justeras för att uppnå önskad värme förhållanden. Temperaturen bör inte vara för höga: detta kommer att smälta och deformeras nålen tips. Efter den grova kanterna jämnas försiktigt vidröra värms glödtråden med nålspetsen och dra försiktigt glödtråden bort från nålen för att generera en spetsig ände (Fig. 1B). En skarp, smidig och ren nål är avgörande för att erhålla intakt givare blastomerer och för att inte skada värd embryon.
4. Förbered ett embryo-positionering sond
Dra ett glas pipett över en gaslåga för att få ett fint glas sond med en jämnas slut. Denna sond kommer att användas för att placera embryon i rätt riktning innan transplantation.
Dag 2. Blastomere transplantation
1. Samla och dechorionate embryon
Nästa dag, ta bort avdelare i korset kassetterna så att fisken att para sig. Placera embryona i en petriskål fylld med E3 vatten. Sedan dechorionate embryon genom att manuellt slita bort chorions från embryon med ett par fina tång. Använd en glaspipett med böjt skaft för att noggrant överföra dechorionated embryon i agaros brunnar. Undvik kontakt embryon med luft, som orsakar de embryon som spricker. Låt embryona utvecklas på 28,5 ° C i agarosen brunnar förrän 3 timmar efter befruktningen, eller HPF.
2. Sätt upp en transplantation apparater
Medan embryon utvecklas, inrätta en transplantation apparat genom att ansluta transplantation nålen till mineral oljefyllda mikro-pumpsystem. Se till att systemet inte läcker och inga luftbubblor fastnar i systemet. Tillbaka fylla hela transplantation nålen med mineralolja, med undantag för 0,5 till 1 l utrymme i spetsen öppningen.
3. Transplantation av blastomerer
Att transplantera blastomerer använder en sond glas positionering för att orientera blastomere sidan av 3-4-HPF embryon uppåt. Sedan försiktigt in transplantation nålen i en givare embryo och sakta suga upp 5-20 blastomerer in nålen. Sätt blastomere fyllda nål i en mängd embryo och släpp blastomerer långsamt. Webbplatsen där blastomerer släpps kommer att påverka var deras avkomma lokalisera i senare utvecklingsstadier. Att analysera näthinnan och hjärnans utveckling, släpp celler vid djuret polen. Under transplantation, se till att nålspetsen inte kontakt med luft. För att minimera mekaniska skador skall värdlandet embryon lämnas kvar i agarosen brunnar vid 28,5 ° C tills nästa dag. Sedan, tverför den mosaiska embryon till 24-brunnars plattor före belagd med 0,5 ml 1% agaros, med ett embryo i varje brunn. 1 ml E3 ägg vatten tillsätts till varje brunn. För att förhindra bakteriella infektioner, tillsätt 10 ìl 100X penicillin och streptomycin till E3 ägget vattnet.
Dag 3. Bädda och leva avbildning av mosaik embryon
1. Bädda embryon
Bered 1,5% låg agaros smältpunkt (LMP) i E3 ägg vatten och Förvara lösningen i ett 30 ° C vattenbad. Överför en mosaik embryo till en FluoroDish vävnadsodling skålen med ett glas botten av 0.17mm i tjocklek (World precisionsinstrument). Avlägsna överskottsvatten E3 vatten att lämna embryot bara omfattas av en minimal mängd av E3. Tillsätt 30-50 l smält 1,5% LMP till embryot. Snabbt läge ögat eller hjärnan så nära glaset botten som möjligt innan agaroslösningen stelnar. Efter lösningen har svalnat, lägga till ytterligare agaroslösningen att ytterligare säkra embryon på plats. Därefter, sänk ned stelnat agaros blocket med 2-3 ml E3 ägg vatten.
2. Konfokala Imaging
För konfokalmikroskopi, är en vatten-immersion inverterad mål (Olympus, PlanApo, 40 X/0.90 WLSM, Japan) med stort fokus djup används. En droppe vatten läggs på målet och sedan placera en FluoroDish maträtt vävnadskultur på målet. För att bilden utveckling, utföra tidsförlopp avbildning genom att ta bilder av embryon var 5 minuter. Beroende på vilken typ av experiment bör tidsintervall mellan bilderna justeras.
Representativa resultat
Figur 2 visar ett representativt 24-HPF mosaik zebrafisk. GFP uttryck belyser donator celler i grönt. Den retinala neuroepiteliala cellerna spänner över hela tjockleken på näthinnan väggen.
Filmen visar rörelserna av givarens celler i den mottagande hjärnan vid 24 HPF. Kallelse celler morfologier förändras över tiden.
Figur 1. Former av transplantation nål tips. A. avfasade öppnandet av spetsen på en nål var fri från skräp efter fluorvätesyra tvättar. B. En spetsiga änden genererades på nålspetsen.
Figur 2. Visualisering av GFP-uttryckande donator celler i en chimär zebrafisk embryon vid 24 HPF. Den vänstra panelen visar GFP signaler i hjärnan och näthinnan. Den mellersta panelen är en ljus fält bild av embryot. Den högra panelen visar den sammanslagna bilden.
Film 1. Live avbildning av GFP positiv donator celler visat på stora förändringar i morfologier av hjärnans neuroepiteliala celler under utveckling. De enskilda bildrutor i filmen samlades in var 5: e minut mellan 24 och 25 HPF. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna video visar vi en metod för blastomere transplantation att analysera näthinnan och hjärnans utveckling hos zebrafisk. Detta protokoll kan också användas för att analysera utvecklingen av andra vävnader och organ genom att helt enkelt släppa givaren blastomerer till motsvarande platser i värden embryon. Märkningen med GFP molekyler ger en renare bakgrund än märkning med fluorescerande färg-konjugerade Dextran (Ho och Kane 1990). Detta beror på skräp av dextran färgämnen från döda givare celler varar mycket längre än GFP och därmed dra slutsatser med imaging (Catalano et al., 2007). Dessutom GFP-positiva givare celler är friskare än de som innehåller Dextran färgämnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av en National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) och följande medel till XW: NIH Grant R01EY016099 och forskning för att förebygga blindhet Award karriärutveckling. Vi tackar Kira Lathrop för att få hjälp i konfokala avbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 ¾" Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-30 | |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| FluoroDish | World Precision Instruments, Inc. | FD35 | |
| Vertical Needle / pipette Puller | David Kopf Instruments | Model 720 | |
| Micro Grinder | Marishige | EG-400 | |
| Micro Forge | Marishige | MF-830 | |
| Manual Microsyringe Pump | World Precision Instruments, Inc. | MMP | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11232-20 | |
| Hydrofluoric Acid | Fisher Scientific | A147-1 | |
| Penicillin- Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | 9012-36-6 | |
| Low melting agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | |
E3 egg water:
|
|||
|
|||
|
|||
References
- Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish. Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).
- Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). THE ZEBRAFISH BOOK. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348, 728-730 (1990).
- Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina. Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).
