移植绿色荧光蛋白表达对视网膜和大脑发育的实时成像嵌合斑马鱼胚胎的卵裂球

Summary

我们展示了协议，实时成像胚胎发育过程中的细胞行为产生的嵌合斑马鱼的胚胎。

Abstract

在自己的位置和财产广泛胚胎发育过程中细胞的变化。这些变化是受细胞和它们的环境之间的相互作用。嵌合胚胎的遗传背景不同的细胞组成的，是伟大的工具来研究基因介导的细胞 - 细胞相互作用。斑马鱼胚胎早期发育阶段的透明度，允许在细胞水平上的组织和器官的形态发生的直接可视。在这里，我们展示了一个协议，以产生在斑马鱼胚胎的嵌合体视网膜和大脑的供体细胞进行实时成像。该协议包括移植针，准备移植绿色荧光蛋白GFP阴性主机，表达捐助卵裂球和捐助现场共聚焦显微镜下的细胞行为的审查。稍作修改，这个协议也可以被用来研究的其他组织和机关在斑马鱼的胚胎发育。使用GFP标签的供体细胞的优点进行了讨论。

Protocol

第1天。制备

1。设置鱼杂交

在晚上设置成对杂交斑马鱼。为了防止随机交配前所需的时间，使用分频器分开，在交配磁带的雌性和雄性的鱼。绿色荧光蛋白表达的转基因鱼，用于捐助卵裂球的来源。 pt104转基因株系（邹等 ，2008），用在这里，表达GFP的无所不在EF1启动子的控制下。 GFP的表达，使供体细胞的可视化实时成像。其他表达合适的荧光蛋白的转基因鱼线，可用于特定需求。

2。准备胚胎控股楔形琼脂糖井

培养皿中，倒入融化，准备在E3蛋水（韦斯特，2007年），1％琼脂糖。飘起了一个塑料模具，琼脂糖溶液楔形突起，让琼脂糖溶液完全凝固。小心取出模具和E3的水浸泡琼脂糖床。

3。准备移植针

使用在电源设置11.5针拉玻璃毛细管移液器（世界精密仪器）一个垂直进针拉马（大卫KOPF仪器）。良好的针尖应与长轴的锥度。在一个45度角的针尖研磨与一个微型磨床（Marishige）（图1A），直到40 -45μm，内径斜面开口。清理针尖，针的钝端连接一根软管，软管连接到一个注射器，然后大吃，并释放了10％的氢氟酸溶液，直到所有可见的碎片被删除。接下来，用蒸馏水洗净的技巧，其次是100％的乙醇。空气干燥，直到所有的乙醇蒸发的针。重要的是要确保提示完全干燥：残留的乙醇会毁在高温抛光步骤针。软化和波兰的针尖粗糙的边缘，一个微型的伪造者的灯丝（Marishige）所产生的热量的烘烤针​​尖。不要让针尖在抛光过程中接触的灯丝。虽然长丝及长丝和针尖之间的距离传递电力的数量可以调整，以达到所需加热的条件下。温度不宜过高：这会熔化和变形的针尖。后粗糙的边缘平滑，仔细触摸针尖加热灯丝，然后轻轻拉动针灯丝产生尖端（图1B）。一个尖锐，光滑，清洁的针是获得完整的捐助者的卵裂球，不损害主机胚胎的关键。

4。准备一个胚胎定位探头

拉过来一个玻璃吸管气体火焰获得精细玻璃探头与理顺结束。这个探测器将用于定位在正确的方向前移植的胚胎。

第2天。卵裂球移植

1。收集和dechorionate胚胎

第二天，在跨磁带删除的分隔，让鱼交配。放置在培养皿中的胚胎充满了E3的水。然后，通过手动撕裂，一双细镊子从胚胎的chorions dechorionate胚胎。使用弯曲轴的玻璃吸管，仔细转移到琼脂糖井dechorionated胚胎。避免任何与空气中的胚胎接触，导致爆裂的胚胎。让胚胎发育为28.5 °琼脂糖水井中的C，直到受精后3小时，或HPF。

2。成立了移植仪器

虽然胚胎的发展，成立了由矿物油填充的微泵系统移植针连接到一个移植仪器。确保系统不漏，无气泡被困在系统。回填土与矿物油整个移植针，除了为0.5 - 1μL的空间，在尖端张开。

3。移植卵裂球

移植卵裂球，用一个玻璃定位探头方向的3 - 4 - HPF胚胎的卵裂球的一侧向上。然后，轻轻插入一个捐助者的胚胎移植针，慢慢地吸进针5-20卵裂球。插入主机胚胎的卵裂球填充针，并慢慢释放的卵裂球。会影响他们的后代在后来的发育阶段的本地化的卵裂球被释放的网站。为了分析视网膜和大脑发育，释放细胞在动物极。在移植过程中，确保针尖不接触空气。为了最大限度地减少机械损伤，主机胚胎应留在28.5 ° C，直到第二天在琼脂糖井。然后，Transfer镶嵌胚胎到24孔板中，用0.5毫升1％琼脂糖预涂，每口井在一个胚胎。 E3蛋水1毫升，每孔加入。为了防止细菌感染，加10μL100X青霉素和链霉素E3蛋水。

第3天。马赛克胚胎的嵌入和实时成像

1。嵌入胚胎

准备在E3蛋水1.5％低熔点琼脂糖（LMP），并保持在30℃水浴的解决方案。的马赛克胚胎转移到一个在0.17毫米玻璃底部厚度FluoroDish组织培养皿（世界精密仪器）。除去多余的E3水离开刚才的E3少量所涉及的胚胎。 30-50μL融化了1.5％LMP胚胎。快速定位的眼睛或大脑尽可能接近的玻璃底前琼脂糖溶液凝固。溶液冷却下来后，添加额外的琼脂糖溶液，以进一步巩固在胚胎。然后，浸泡2-3毫升E3蛋水的凝固的琼脂糖块。

2。共焦成像

共聚焦显微镜，一个水浸泡倒置的目标与大聚焦深度（奥林巴斯，PlanApo，40 X/0.90 WLSM，日本）使用。一滴水添加到目标，然后放置一个FluoroDish组织培养皿上的目标。图像的发展，执行的胚胎，每5分钟拍照时间推移成像。根据实验的性质，镜头之间的时间间隔应进行调整。

代表性的成果

图2显示了有代表性的24 HPF镶嵌斑马鱼。 GFP表达突出绿色的供体细胞。视网膜神经上皮细胞覆盖整个视网膜壁的厚度。

影片中展示了24 HPF主机大脑的供体细胞的运动。公告细胞形态随时间变化的。

图1移植针尖的形状。答：一针针尖斜面开放氢氟酸清洗后的碎片。 B.尖端产生的针尖。

图2。可视化绿色荧光蛋白表达的供体细胞嵌合斑马鱼的胚胎在24 HPF。左侧面板显示绿色荧光蛋白在大脑和视网膜的信号。面板中间是一个明亮的胚胎领域的图片。右侧的面板显示合并后的图像。

电影1。现场GFP阳性的供体细胞成像显示出广泛的在发展过程中大脑的神经上皮细胞的形态变化。电影中的个别帧，共收集了24和​​25 HPF之间，每5分钟，点击这里看电影。

Discussion

在这段视频中，我们展示了一个卵裂球移植的方法来分析在斑马鱼的视网膜和大脑发育。此协议也可以用来分析其他组织和器官的发展，在主机的胚胎捐赠者卵裂球，只需释放到相应的位置。与绿色荧光蛋白分子的标签产量比用荧光染料标记的葡聚糖（何和凯恩1990年）标签的背景清洁。这是因为右旋糖酐染料从死亡的供体细胞的碎片持续更长的时间比绿色荧光蛋白，从而推断成像（卡塔拉诺等，2007年）。此外，GFP阳性的供体细胞比那些含有葡聚糖染料的健康。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 ¾" Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-30
Borosilicate Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	1B100F-4
FluoroDish	World Precision Instruments, Inc.	FD35
Vertical Needle / pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 720
Micro Grinder	Marishige	EG-400
Micro Forge	Marishige	MF-830
Manual Microsyringe Pump	World Precision Instruments, Inc.	MMP
Forceps	Fine Science Tools	11232-20
Hydrofluoric Acid	Fisher Scientific	A147-1
Penicillin- Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Agarose	Research Products International Corp.	9012-36-6
Low melting agarose	Fisher Scientific	BP165-25
E3 egg water: 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO4 0.1% methylene blue
5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO4 0.1% methylene blue
5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO4 0.1% methylene blue