Summary
Die molekulare Basis der räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen wird untersucht mit Hilfe von transgenen Pflanzen, die Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom Mängel aufweisen. Die Isolierung von spezifischen Zellen mit induzierter Phytochrom-Chromophor Abreicherung durch Fluorescence-Activated Cell Sorting gefolgt von Microarray-Analysen wird genutzt, um Gene in räumlich-spezifische Phytochrom Reaktionen beteiligt sind.
Abstract
Licht vermittelt eine Reihe von Entwicklungs-und adaptive Prozesse über den gesamten Lebenszyklus einer Anlage. Pflanzen nutzen Licht absorbierende Moleküle, so genannte Photorezeptoren zu spüren und sich an Licht. Die rot / Dunkelrot-Licht-absorbierenden Photorezeptoren Phytochrom wurden umfassend untersucht. Phytochrome existieren als eine Familie von Proteinen mit unterschiedlichen und sich überschneidenden Funktionen in allen höheren Pflanzen, in denen sie studiert haben,
Protocol
1. Plant Growth
- Bestätigt UAS-BVR X GAL4-GFP-Enhancer trap line isoliert als 4 beschrieben (Zusammenfassung siehe Abb.. 1) und Wildtyp-oder elterlichen Linien sind auf den Boden gesät, dh ~ 2000 sterilisierten Samen pro Zeile.
- Pflanzen sind für 5 Wochen auf den Boden unter weißer Beleuchtung von 100 μmolm -2 s -1 gewachsen bei 22 ° C und 70% Luftfeuchtigkeit.
2. Blatt Protoplastenisolierung (angepasst von Denecke und Vitale 9)
- Zur Isolierung Protoplasten, bereiten TEX-Puffer. Für 1 Liter TEX-Puffer, wiegen Sie die folgenden Komponenten: 3,1 g Gamborg die B5-Salze, 0,5 g 2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES, 2,56 mM), 0,75 g Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g Ammoniumnitrat (NH 4 NO 3, 3,12 mM), auflösen 136,9 g Saccharose (0,4 Mio.). Bauteile komplett in ~ 900 ml entionisiertem, destilliertem Wasser (ddH 2 O) und bringen Sie den pH-Wert auf 5,7 mit 1 M KOH. Bringen Endvolumen von 1 Liter und Filter sterilisieren mit einem 0,2 &mgr; Flaschenaufsatz-Filter angeschlossen an eine Vakuumpumpe.
- Sammeln Sie grüne, gesunde Blätter von Pflanzen (~ 250 ml der Blätter lose in ein Becherglas verpackt) und spülen Sie mit ~ 40 ml ddH 2 O 4-mal, gefolgt von Spülen zweimal mit sterilem ddH 2 O. Mit einem Nr. 20 Skalpell schneiden Blätter in feine Streifen schneiden und spalten Gewebe zu gleichen Teilen in zwei 50 ml sterile Kunststoffröhrchen. Bereiten 1x Blatt Verdauung durch Zugabe von 5 ml Aliquot 10x Blatt Verdauung Stammlösung (10x Blatt Verdauung Stammlösung: Man löst 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v Cellulase "Onozuka" R-10 in TEX-Puffer, Filter sterilisieren mit 0,2 um Filter und frieren 5 ml Aliquots bei -80 ° C) auf 45 ml frisches TEX-Puffer. Add ~ 25 ml 1x Blatt Verdauung Mischung pro 50 ml Tube für alle Blattgewebe zu decken.
- Vacuum infiltrieren Blattgewebe in Verdaumischung in offenen Röhren für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Vakuum-Exsikkator an eine Wasserpumpe mit 3-hr Inkubation bei Raumtemperatur auf einer Wippe unter leichtem Schütteln folgte. Capped Rohre mit Blattgewebe in 1x Blatt Verdauung Mix sind in Alufolie aufbewahrt während dieses Prozesses umwickelt, um Lichteinfall zu verhindern.
- Nach 3 Stunden, erhöhen Sie die Wippe Geschwindigkeit für ca. 2 Minuten bis Protoplasten freizugeben. Filter das rohe Protoplastensuspension durch zwei Schichten sterile Gaze, um Ablagerungen zu entfernen und das Filtrat in ein steriles Becherglas. Filter das Filtrat durch einen sterilen 100-um Nylon-Mesh in eine sterile Petrischale. Sammeln Sie die Durchströmung und übertragen sie auf eine neue sterile 50 ml-Tube. Verwenden Sie ca. 15-20 ml frischem TEX Puffer, um die sterile Petrischale waschen und sammeln keine Protoplasten an der Oberfläche haften.
- Centrifuge die Durchströmung mit einem Swing-Eimer Rotor bei 100xg bei 10 ° C für 15 min (Acceleration 6, Verzögerung 0).
- Nehmen Sie ~ 25 bis 30 ml der Flüssigkeit unterhalb der schwimmenden Protoplasten Schicht, die Rest-und pelletiert Schmutz enthält, mit einer sterilen 9 "Glas Pasteur Pipette an einer Schlauchpumpe, ohne die schwimmenden Protoplasten Schicht und verlassen ~ 10 bis 15 ml Volumen.
- Add frischen TEX-Puffer auf ein Endvolumen von 40 ml, während sanft Resuspendieren des Protoplasten.
- Wiederholen Sie die Schritte 2,5 bis 2,7 zweimal so viel Zelltrümmer wie möglich zu entfernen. Die Zentrifugation der Zeit ist, 10 Minuten in der ersten Wiederholung und 5 Minuten in der letzten Wiederholung reduziert.
- Absaugen schwimmenden Protoplasten mit einem Schnitt, sterile 1 ml Transferpipette in ein neues 15 ml Tube. Gehen Sie direkt zu sortieren oder zu speichern in Dunkeln bis zu 2 Stunden bei 4 ° C bis zur Sortierung.
3. Protoplast Sortierung nach Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
- Vor dem Sortieren untersuchen Protoplasten durch konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) mit einem 488-nm-Laser für die Anregung zu Protoplasten Integrität und die Anwesenheit von GFP-Fluoreszenz in den Protoplasten Pool zu bestätigen. Minimal Schutt ist notwendig, um Verstopfungen zu vermeiden die FACS-Sortierung Düse.
- Sortieren isolierten Protoplasten in TEX-Puffer über FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) mit einer 200-um Düse auf der Makro-Art Kopf Ereignisraten zwischen 6.000 und 15.000, mit einem Systemdruck von etwa 9 psi nach einem adaptierten Protokoll 10.
- Wild-Typ nicht-GFP Protoplasten werden verwendet, um die Autofluoreszenz Schwellenwerte zu ermitteln.
- Um GFP-positive Protoplasten, Art-Zellen mit einem luftgekühlten Argonlaser (Spectra Physics Modell 177, Newport Corporation, Irvine, CA) betrieben bei 100 mW auf einer 488-nm Argon Linie GFP-Fluoreszenz zu identifizieren mit einem 530/30 Band sammeln Pass-Filter.
- Nach der Sammlung von GFP-positive Protoplasten untersuchen sortiert Protoplasten durch CLSM wie in Schritt 3.1.
- Auszug Gesamt-RNA aus sortierten Protoplasten unter Verwendung eines Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. cDNA kann dann für die Hybridisierung hergestellt werden, wie in Affymetrix GeneChip Expr beschriebenITZUNG Analysis Technical Manual und dann hybridisiert ATH1 Arabidopsis Affymetrix Whole Genome-Arrays.
Repräsentative Ergebnisse
Wir erkannten eine beträchtliche Anzahl von GFP-positive Zellen im GFP-Kanal durch FACS (Abb. 2). In Optimierung Tests unter Verwendung von GFP-Enhancer-trap Eltern, die konstitutiv GFP-exprimierenden Linie, J0571, angezeigt ~ 17% auf 24% GFP-positive Protoplasten, während die Linie mit vaskulären und dermalen Ausdruck, J1071, hatte ~ 1,4% GFP-positive Protoplasten (Tabelle 1). Sortieren von 3 x 500 ul (~ 1,5 ml insgesamt Protoplastensuspension) von J0571 Protoplasten für 1 h gab ~ 100.000 GFP-positive Protoplasten. Sortieren von 3 x 500 ul (~ 1,5 ml insgesamt Protoplastensuspension) von J1071 Protoplasten für 1,5 h gab ~ 3.000 GFP-positive Protoplasten. Konfokale Bilder zeigte eine sehr hohe Ausbeute an Protoplasten für J0571 und J1071 Proben vor der Sortierung wurde (Abb. 3C und 3E) durchgeführt, und die sortierten Fraktionen enthielten nur helle GFP-Fluoreszenz-Protoplasten (Abb. 3G und Daten nicht gezeigt). Dieser Befund bestätigt, dass intakte GFP-positive Protoplasten via FACS sortiert werden können. Die nicht-GFP Protoplasten können auch sortiert und gesammelt in einem separaten Kanal. Die nicht-GFP Protoplasten dienen als ideales negative Kontrolle für die anschließende Microarray-Analysen auf die spezifischen Veränderungen der Genexpression bei der Reduktion von holophytochrome Ebenen zu erkennen. RNA-Extraktion aus isolierten Protoplasten (1 ml) ergibt RNA in ausreichender Menge für den Nachweis von fluorospectrometry (Abb. 4). Isolierte RNA wurde anhand einer NanoDrop Instrument (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) und quantifiziert NanoDrop 3.7.1 RNA-Quantifizierung Software. RNA-Ausbeuten aus C24-Wildtyp-Protoplasten oder FACS-sortiert, überschritten GFP-positive enhancer trap Protoplasten die mindestens 20 ng für den Einsatz in brauchte vorsortiert RNA-Labeling-Assays für die Microarray-(Tabelle 2).
| Enhancer-Trap-Linie | % Der GFP-positive Protoplasten | Anzahl der sortierten GFP Protoplasten |
| J0571 | 17,18% ~ 24,06% | 26.400 ~ 36.000 |
| J1071 | ~ 1,43% | 1.000 ~ 1.300 |
Tabelle 1. Anteil der GFP-positive Protoplasten von zwei Enhancer-trap-Linien vor der Sortierung und der Anzahl der GFP-positive Protoplasten, indem Sie 500 ul der Protoplastensuspension durch die Fluorescence Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD) gesammelt.
| Pflanzenlinie | RNA-Ausbeute (ng) |
| C24 WT | 12486,5 |
| J0571 | 60 |
| J1071 | 71,5 |
Tabelle 2. Von RNA-Isolierung aus Protoplasten Yield. RNA wurde aus vorsortierten C24-Wildtyp-oder sortiert GFP-positive Protoplasten von zwei enhancer trap Linien isoliert und quantifiziert.
Abbildung 1. GAL4-Enhancer-trap-basierte Induktion von Biliverdin-Reduktase (BVR) die Expression in transgenen Arabidopsis thaliana Pflanzen. (A). Ein einzelner aus einer Bibliothek von GAL4-basierten Enhancer-trap-Linien, die eine GAL4-responsive GFP-Markergen enthält, ausgewählt werden kann mit einer Zeile mit einem GAL4-responsive Zielgen um die Expression des Zielgens in induzieren GAL4-enthaltenden Zellen markiert überquert werden von GFP-Fluoreszenz. Basierend auf einer Figur aus Dr. Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) Herstellung von Phytochrom-Chromophor, Phytochromobilin (PΦB) und holophytochrome in übergeordneten Linien. (C) links, Reduktion von Biliverdin IXα (BV IXα) und PΦB von Biliverdin-Reduktase (BVR) Aktivität BR und PΦR jeweils. BVR-Aktivität führt zu Erschöpfung der PΦB und führt zu einer Reduktion bei der Herstellung von photoaktiven holophytochrome. Richtig, wird die Reaktion durch BVR katalysierten gezeigt.
Abbildung 2. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Erwerb Dot-Plots. Vergleich von Protoplasten Zellsortierung für C24-Wildtyp (A), J0571 (B) und J1071 (C). (A) Erwerb Dot-Plot von nicht-fluoreszierenden GFP C24-Wildtyp-Protoplasten durch ein 488-nm Argon-Laser angeregt und zur Autofluoreszenz Schwelle zu bestimmen. (B) und (C) Erwerb Dot-Plots zeigen Anteile von Protoplasten, dass GFP positive Reaktion auf Anregung durch einen 488-nm-Laser sind. R3 Sortierweichen in B und C begrenzen die GFP-positive Ziele, die durch Fluorescence-Activated Cell Sorter sortiert wurden (FACSVantage, BD) und gesammelt. Red-Kanal zeigt verte für Chlorophyll-Autofluoreszenz von Protoplasten und grünen Kanal zeigt Werte für GFP-Fluoreszenz.
Abbildung 3. Konfokale Mikroskopie von pflanzlichen Protoplasten für die Zell-Sortierung eingesetzt. Konfokalen Laser-Scans von Protoplasten vor (A, C, E) und nach (G) Sortierung über Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS). B, D, F und H sind DIC Bilder. Protoplasten von C24-Wildtyp (A, B), J1071 (C, D) und J0571 (E, F, G, H) gezeigt. Und Autofluoreszenz (LP 650 nm) aus Anregung mit einem 488-nm-Laser erzielt - Bilder C, E und G sind Bilder von GFP-Fluoreszenz (575 nm BP 505 nm) zusammengeführt. A bis H sind durchschnittlich 4 Scans unter 63x Öl. Bar = 10 pm.
Abbildung 4. Quantifizierung von RNA aus Protoplasten durch fluorospectrometry isoliert. RNA von (A) C24 Wildtyp (B) J0571 und (C) J1071 extrahiert. A zeigt RNA für vorsortierte Wildtyp-Protoplasten. B und C zeigen RNA aus GFP-positive Protoplasten durch Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) sortiert. RNA-Quantifizierung Software, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).
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Discussion
Gene Expression Profiling durch Mikroarrays (1) hat angedeutet, dass mehr als 30% der Gene in Arabidopsis-Keimlinge Licht reguliert 11 sind und (2) hat eine große Gruppe von Genen, Licht Signaltransduktionsproteine in der Phytochrom Signalkaskade 12, 13 beteiligten identifiziert . Solche Experimente deuten darauf hin, dass Licht eine schnelle und langfristige Veränderungen in der Genexpression induziert. Jeder Pool von Phytochrome kann die Kontrolle nur eine Teilmenge der Entwicklungs-und Anpassungsmaßnahmen. Darüber hinaus ist es wahrscheinlich, dass die nachgeschalteten Signalkomponenten mit Phytochrome in einem Zell-und Gewebe-spezifische Weise 2, 14, 15 zusammenwirken.
Die Expression von nachgeschalteten Kandidatengene können hoch-oder herunter reguliert auf gezielte BVR Ausdruck. Durch vergleichende Analyse von Veränderungen der Genexpression im UAS-BVR X GAL4-GFP Nachkommen und Eltern Linien können wir identifizieren, deutliche Veränderungen in der Genexpression, soweit diese Änderungen ergeben sich aus lokalisierte Phytochrom Mängel. Basierend auf Genexpressionsprofile, können wir Gene identifizieren, die negativen und positiven Faktoren in Phytochrom-vermittelten Zell-Zell-Signalisierung zu kodieren. Jüngste Daten legen nahe, dass mehrere hundert Transkripte von Protoplastierung von Pflanzengewebe 16 sind induziert. So ist der ideale negative Kontrolle für die Microarray-Analyse von RNA aus nicht-GFP Protoplasten bei der Sortierung gesammelt isoliert. Transkripte, die von Protoplastierung von Pflanzengewebe induziert werden können aus der Datenanalyse mit Hilfe dieser Kontrollen ausgeschlossen werden, was die Identifizierung von Zielgenen speziell in Gewebe-und Organ-spezifische Phytochrom-Signalisierung und / oder Reaktionen beteiligt. Um zu bestätigen, steady-state Veränderungen in der Expression von Genen über Zelltyp-spezifische Expression Profiling identifiziert haben, können qRT-PCR auf Poly (A) RNA durchgeführt, das aus der sortierten GFP-positiven und GFP-negativen Protoplasten.
Gene, deren Expression signifikant in Microarray-Analysen verändert und bestätigt durch qRT-PCR werden als Kandidaten in diskreten Phytochrom-vermittelten interzellulären Signalübertragung beteiligt sind. Wenn T-DNA Insertionsmutanten bereits in Kandidatengenen verfügbar ist, kann sie für leichte Beeinträchtigung Phänotypen analysiert werden. Durch den Vergleich der Phänotypen von Mutanten, die Mutationen in Kandidatengenen und bekannten Phytochrom-Mutanten mit dem Wildtyp, können wir identifizieren, spezifische Reaktionen, in denen Kandidatengene haben regulatorische Funktionen. Wenn die Mutanten mit Mutationen in Kandidatengenen Phytochrom-defizienten Phänotyp-Display, wird dies bestätigen, dass die identifizierten nachgeschalteten Zielgene bei der Vermittlung von verschiedenen Phytochrom-regulierten Reaktionen beteiligt sind.
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Acknowledgments
Die Arbeit in der Montgomery-Labor auf Phytochrom Reaktionen in Pflanzen wird durch die National Science Foundation (Grant No. MCB-0919100 bis BLM) und der Chemical Sciences, Geosciences and Biosciences Division, Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of unterstützt Energy (Grant No. DE FG02 91ER20021 zu BLM). Wir danken Melissa Whitaker für die technische Unterstützung während der Dreharbeiten und kritische Durchsicht des Manuskripts, Stephanie Costigan für experimentelle Mitarbeit, Dr. Louis King für die Unterstützung bei der Entwicklung und Optimierung Fluorescence-Activated Cell Sorting Protokolle für Arabidopsis Protoplasten Sortierung und Dr. Melinda Rahmen für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie. Wir bedanken uns bei Marlene Cameron für die grafische Gestaltung Unterstützung und Karen Vogel für redaktionelle Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | |
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis | MSPC 0930 | |
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma-Aldrich | G5768 | |
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis | PTC 001 | |
| MES, low moisture content | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | |
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | |
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
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