Summary
Den molekylära grunden för rumslig-specifika phytochrome svar utreds med hjälp av transgena växter som uppvisar vävnader och organ-specifika phytochrome brister. Isolering av specifika celler uppvisar inducerad phytochrome kromofor utarmning av Fluorescens-Aktivt cellsortering följt av microarray-metoder håller på att utnyttjas för att identifiera gener som är involverade i fysisk-specifika phytochrome svar.
Abstract
Ljus förmedlar en rad utvecklings-och adaptiva processer i hela livscykeln för en växt. Växter använder ljusabsorberande molekyler som kallas fotoreceptorer att känna av och anpassa sig till ljuset. Den röda / långt rött ljusabsorberande phytochrome fotoreceptorer har studerats ingående. Phytochromes existera som en familj av proteiner med olika och överlappande funktioner i alla högre växt system där de har studerat
Protocol
1. Växternas tillväxt
- Bekräftade UAS-BVR X GAL4-GFP förstärkare trap line isolerade enligt 4 (för sammanställning se figur. 1) och vildtyp eller föräldralinjer sås på mark, dvs ~ 2000 steriliserade frön per rad.
- Växter odlas i 5 veckor på mark under vit belysning av 100 μmolm -2 s -1 vid 22 ° C och 70% luftfuktighet.
2. Leaf protoplastfusion Isolering (anpassad från Denecke och Vitale 9)
- Att isolera protoplasts, förbereda TEX buffert. För 1 liter TEX buffert, väg upp följande komponenter: 3,1 g Gamborg är B5 salter, 0,5 g 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES, 2,56 mM), 0,75 g kalciumkloriddihydrat (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mm), 0,25 g ammoniumnitrat (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g sackaros (0,4 miljoner). Lös komponenter helt i ~ 900 ml avjoniserat, destillerat vatten (DDH 2 O) och pH justeras till 5,7 med en M KOH. Ta slutliga volymen till 1 liter och filtrera sterilisera med 0,2 ìm flaska-top-filter ansluts till en vakuumpump.
- Samla gröna, friska blad från växter (~ 250 ml bladen löst packad i en bägare) och skölj med ~ 40 ml DDH 2 O 4 gånger, följt av sköljning två gånger med sterilt DDH 2 O. Med hjälp av en # 20 skalpell, skär bladen i tunna strimlor och dela vävnad lika i två 50 ml sterila plaströr. Förbered 1x blandning blad matsmältningen genom att tillsätta 5 ml alikvot av 10x blad matsmältningen stamlösning (10x blad matsmältning stamlösning: Lös upp 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v cellulas "Onozuka" R-10 i TEX buffert, Filtret sterilisera med 0,2 ìm filter och frysa 5 ml alikvoter vid -80 ° C) till 45 ml färsk TEX buffert. Tillsätt ~ 25 ml 1X blad matsmältningen blanda per 50 ml tub för att täcka alla bladvävnad.
- Vakuum infiltrera bladvävnad i matsmältningen blandning i öppna rör för 1 timme i rumstemperatur med hjälp av en vakuumexsickator ansluten till en vattenpump följt av 3-tim inkubation vid rumstemperatur på en rocker med försiktig skakning. Capped rör med bladvävnad i 1x blad matsmältningen mix hålls insvept i aluminiumfolie under denna process för att förhindra exponering för ljus.
- Efter 3 timmar, ökar rocker hastigheten för ~ 2 minuter för att släppa protoplasts. Filtrera rå protoplastfusion fjädring genom två lager av sterila ost trasa för att avlägsna skräp och samla in filtratet i en steril glasbägare. Filtrera filtratet genom ett sterilt 100-ìm nylonmesh i en steril petriskål. Samla flödet genom och överföra den till en ny steril 50 ml-rör. Använd ca 15-20 ml rent TEX buffert för att tvätta steril petriskål och samlar alla protoplasts fastnat på ytan.
- Centrifugera flödet genom att använda en rotor gunga hink på 100xg vid 10 ° C i 15 min (Acceleration 6, retardation 0).
- Ta bort ~ 25 - 30 ml av vätskan under flytande protoplastfusion skikt, som innehåller rester och pelleterat skräp, med en steril 9 "glas pasteurpipett ansluten till en Slangpumpar utan att störa den flytande protoplastfusion lagret och lämnar ~ 10 - 15 ml volym.
- Lägg färska TEX buffert för att en slutlig volym på 40 ml, medan försiktigt resuspending de protoplasts.
- Upprepa steg från 2,5 till 2,7 två gånger för att ta bort så mycket cellulärt skräp som möjligt. Centrifugeringstiden reduceras till 10 minuter i första upprepning och till 5 minuter i finalen upprepning.
- Aspirera flytande protoplasts med ett snitt, steril 1 ml överföringspipett i en ny 15 ml rör. Gå direkt till sortering eller butik i mörker upp till 2 timmar vid 4 ° C tills sortering.
3. Protoplastfusion Sortering av Fluorescens-Aktivt cellsortering (FACS)
- Innan sortering, undersöka protoplasts av Confocal laserscanning Mikroskopi (CLSM) med en 488-nm laser för excitation att bekräfta protoplastfusion integritet och förekomsten av GFP fluorescens i protoplastfusion poolen. Minimal skräp är nödvändigt att undvika igensättning av FACS sortering munstycket.
- Sortera isolerade protoplasts i TEX buffert via FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) med en 200-ìm munstycke på ett makro slags huvudet på evenemanget priser mellan 6000 och 15.000, med ett systemtryck på ca 9 psi efter en anpassad protokoll 10.
- Vildtyp icke-GFP protoplasts används för att bestämma autofluorescens trösklar.
- Att samla GFP-positiva protoplasts, sortera celler med en luftkyld argon laser (Spectra Physics Model 177, Newport Corporation, Irvine, CA) drivs på 100 mW på en 488-nm argon line för att identifiera GFP fluorescens med hjälp av en 530/30 band lågpassfilter.
- Efter insamling av GFP-positiva protoplasts undersöka sorterade protoplasts av CLSM enligt beskrivningen i steg 3,1.
- Utdrag totala RNA från sorterade protoplasts med en Qiagen RNeasy växt Mini Kit. cDNA kan då vara beredd på hybridisering som beskrivs i Affymetrix GeneChip Expression Analys Teknisk handbok och sedan hybridiseras till AtH1 Arabidopsis Affymetrix hela genom matriser.
Representativa resultat
Vi upptäckte ett stort antal GFP-positiva celler i GFP kanal genom FACS (Fig. 2). I optimering analyser med hjälp av GFP förstärkare-fällan föräldrar, konstitutivt GFP-uttryckande linje, J0571, visade ~ 17% till 24% GFP-positiva protoplasts, medan linje med kärl-och huden uttryck, J1071, hade ~ 1,4% GFP-positiva protoplasts (tabell 1). Sortering av 3 x 500 l (~ 1,5 ml totalt protoplastfusion suspension) av J0571 protoplasts för 1 h gav ~ 100 tusen GFP-positiva protoplasts. Sortering av 3 x 500 l (~ 1,5 ml totalt protoplastfusion suspension) av J1071 protoplasts för 1,5 h gav ~ 3000 GFP-positiva protoplasts. Konfokala bilder visade en mycket hög avkastning av protoplasts för både J0571 och J1071 prover före sortering gjordes (Fig. 3C och 3E), och sorterade fraktioner innehöll endast ljusa GFP-fluorescerande protoplasts (bild 3G och data visas inte). Detta resultat bekräftar att intakta GFP-positiva protoplasts kan sorteras via FACS. Den icke-GFP protoplasts kan också sorteras och samlas i en separat kanal. Den icke-GFP protoplasts fungera som en perfekt negativ kontroll för efterföljande microarray-analyser för att upptäcka specifika förändringar i genuttryck vid minskning av holophytochrome nivåer. RNA-extraktion från enstaka protoplasts (1 ml) ger RNA på tillräcklig mängd för detektion av fluorospectrometry (bild 4). Isolerade RNA har utvärderats med hjälp av en NanoDrop instrument (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) och kvantifieras av NanoDrop 3.7.1 RNA kvantifiering programvara. RNA avkastningen från försorterade C24 vildtyp protoplasts eller FACS-sorteras, översteg GFP-positiva förstärkare fälla protoplasts den minsta 20 ng som behövs för användning i RNA-märkning analyser för microarray (tabell 2).
| Enhancer trap line | % Av GFP-positiva protoplasts | Antal sorterade GFP protoplasts |
| J0571 | 17,18% ~ 24,06% | 26.400 ~ 36 tusen |
| J1071 | ~ 1,43% | 1000 ~ 1300 |
Tabell 1. Andel GFP-positiva protoplasts från två förstärkare fällan linjer före sortering och antalet GFP-positiva protoplasts samlas in genom att köra 500 mikroliter av protoplastfusion fjädring genom aktiverat Fluorescens Cell Sorter (FACSVantage, BD).
| Plantera Linje | RNA avkastning (NG) |
| C24 WT | 12486,5 |
| J0571 | 60 |
| J1071 | 71,5 |
Tabell 2. Yield från RNA isolering från protoplasts. RNA var isolerad från försorterade C24 vildtyp eller sorteras GFP-positiva protoplasts från två förstärkare fälla linjer och kvantifieras.
Figur 1. GAL4 förstärkare-trap-baserade induktion av Biliverdin reduktas (BVR) uttryck i transgena Arabidopsis thaliana växter. (A). En individ väljs från ett bibliotek av GAL4-baserad förstärkare fälla linjer, som innehåller en GAL4-lyhörd genen GFP markör kan korsas med en linje som innehåller en GAL4-lyhörd målgenen att inducera uttryck av målgenen i GAL4 innehåller markerade celler av GFP fluorescens. Baserat på en siffra från Dr Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) produktion av phytochrome kromofor, phytochromobilin (PΦB) och holophytochrome i förälder linjer. (C) Vänster, Minskning av biliverdin IXα (BV IXα) och PΦB genom biliverdin reduktas (BVR) verksamhet för att BR och PΦR, respektive. BVR aktivitet resulterar i utarmning av PΦB och leder till en minskning i produktionen av fotoaktiva holophytochrome. Höger, är reaktionen katalyseras av BVR visas.
Figur 2. Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS) förvärv dot tomter. Jämförelse av protoplastfusion cell sortering för C24 vild typ (A), J0571 (B) och J1071 (C). (A) Förvärv dot plot av icke-GFP fluorescerande C24 vildtyp protoplasts upphetsad av en 488-nm argon laser och används för att bestämma autofluorescens tröskel. (B) och (C) förvärv dot tomter visar proportioner protoplasts som GFP positiva svar på excitation av en 488-nm laser. R3 sortering portar i B och C avgränsa GFP-positiva mål som var sorterade efter Fluorescens-Aktivt Cell Sorter (FACSVantage, BD) och samlas in. Röda kanalen visar values för klorofyll autofluorescens från protoplasts och gröna kanalen visar värden för GFP fluorescens.
Figur 3. Konfokalmikroskopi av anläggningar protoplasts används för cell sortering. Konfokala laserscanning bilder av protoplasts innan (A, C, E) och efter (G) sortering via Fluorescens-Aktivt Cell Sorter (FACS). B, D, F och H är DIC bilder. Protoplasts av C24 vild typ (A, B), J1071 (C, D) och J0571 (E, F, G, H) visas. Bilder C, E och G är sammanfogade bilder av GFP fluorescens (BP 505 nm - 575 nm) och autofluorescens (LP 650 nm) som erhållits från excitation med en 488-nm laser. A till H är i genomsnitt 4 sökningar i 63x olja. Bar = 10 mikrometer.
Figur 4. Kvantifiering av RNA isolerat från protoplasts av fluorospectrometry. RNA ur (A) C24 vild typ, (B) J0571, och (C) J1071. En indikerar RNA för pre sorterat-vildtyp protoplasts. B och C anger RNA från GFP-positiva protoplasts sorterade efter Fluorescens-Aktivt cellsortering (FACS). RNA kvantifiering programvara, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gene expression profiling genom microarrays (1) har visat att mer än 30% av de gener i Arabidopsis plantor är lätta regleras 11 och (2) har identifierat en stor grupp av gener som kodar ljuset proteiner signaltransduktion inblandade i phytochrome signalering kaskad 12, 13 . Sådana experiment tyder på att ljus inducerar snabb och långsiktiga förändringar i genuttryck. Varje pool av phytochromes kan styra bara en delmängd av utvecklings-och adaptiva svar. Dessutom är det troligt att nedströms signalering komponenterna samverkar med phytochromes i en cell-och vävnads-specifika sätt 2, 14, 15.
Uttrycket av nedströms gener kan vara upp-eller ned-reglerade på riktade BVR uttryck. Genom jämförande analys av förändringar genuttryck i UAS-BVR X GAL4-GFP avkomma och föräldrarnas linjer, kan vi identifiera tydliga förändringar i genuttryck om ändringarna beror på lokala phytochrome brister. Baserat på genuttryck profiler, kan vi identifiera gener som kodar negativa och positiva faktorer i phytochrome-medierad cell-till-cellsignalering. Aktuella uppgifter tyder på att flera hundra utskrifter induceras av protoplasting av växtvävnad 16. Således är den idealiska negativa kontrollen för microarray analys RNA isoleras från icke-GFP protoplasts in under sorteringen. Avskrifter som induceras av protoplasting av växtvävnad kan uteslutas från data analys med dessa kontroller, vilket resulterade i identifiering av mål gener specifikt inblandade i vävnader och organ-specifika phytochrome signal-och / eller svar. För att bekräfta steady state förändringar i uttrycket av gener som identifierats via cell-typspecifika expression profiling kan QRT-PCR utföras på Poly (A) RNA från den sorterade GFP-positiva och GFP-negativa protoplasts.
Gener vars uttryck är förändrats markant under microarray analyser och bekräftats av QRT-PCR är identifierade som kandidater inblandade i diskret phytochrome-medierad intercellulära signaler. Om T-DNA insättning mutanter finns redan i gener, de kan analyseras för lätt nedsatt fenotyper. Genom att jämföra fenotyper av mutanter bär mutationer i gener och kända phytochrome mutanter till vilda typen kan vi identifiera specifika svar i vilken kandidat gener har reglerande roller. Om mutanter med mutationer i gener visa phytochrome-brist fenotyper, kommer detta att bekräfta att den identifierade nedströms mål gener som är inblandat i olika phytochrome-reglerade svar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbetet i Montgomery labbet på phytochrome reaktioner i växter stöds av National Science Foundation (bidrag nr. MCB-0.919.100 till BLM) och Chemical Sciences, geovetenskaper och biovetenskaper Division Office of Basic Energy Sciences, Office of Science, US Department of Energi (bidrag nr. DE FG02 91ER20021 till BLM). Vi tackar Melissa Whitaker för tekniskt stöd under inspelningen och kritiskt läsa manuskriptet, Stephanie Costigan för experimentell hjälp, Dr Louis King för hjälp med att utveckla och optimera Fluorescens-aktiverade cellsortering protokoll för Arabidopsis protoplastfusion sortering och Dr Melinda Ram för hjälp med konfokala mikroskopi. Vi tackar Marlene Cameron för grafisk design hjälp och Karen Bird för redaktionell hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-BVR antibody | QED Bioscience Inc. | 56257-100 | |
| Cellulase “Onozuka” R-10 | SERVA Electrophoresis | MSPC 0930 | |
| Gamborg’s B5 basal salt mixture | Sigma-Aldrich | G5768 | |
| Macerozyme R-10 | SERVA Electrophoresis | PTC 001 | |
| MES, low moisture content | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Murashige and Skoog salts | Caisson Laboratories | 74904 | |
| Phytablend | Caisson Laboratories | 28302 | |
| RNeasy Plant Minikit | Qiagen | 16419 |
References
- Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
- Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
- Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
- Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
- Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
- Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
- Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
- Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
- Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
- Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
- Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
- Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
- Ulm, R., &, N. agy, F, Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
- Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
- Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. hory, J, Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
- Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).
