Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana Published: May 29, 2010 doi: 10.3791/1925

Summary

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Abstract

Licht bemiddelt een scala van ontwikkelings-en adaptieve processen in de levenscyclus van een plant. Planten gebruiken licht-absorberende moleculen, de zogenaamde fotoreceptoren te voelen en aan het licht aan te passen. De rood / ver-rood licht-absorberende fytochroom fotoreceptoren zijn uitgebreid bestudeerd. Phytochromes bestaan ​​als een familie van eiwitten met verschillende en overlappende functies in alle hogere plant systemen waarin ze zijn bestudeerd

Protocol

1. Plant Groei

  1. Bevestigd UAS-BVR X GAL4-GFP enhancer geïsoleerd trap lijn zoals beschreven 4 (voor samenvatting zie Fig. 1) en de wild-type-of ouderschapsverlof lijnen zijn gezaaid op aarde, dat wil zeggen ~ 2000 gesteriliseerd zaden per lijn.
  2. Planten worden gekweekt voor 5 weken op bodem onder witte verlichting van 100 μmolm -2 s -1 bij 22 ° C en 70% luchtvochtigheid.

2. Leaf protoplast Isolatie (aangepast uit Denecke en Vitale 9)

  1. Te isoleren protoplasten, voor te bereiden TEX buffer. Voor 1 liter TEX buffer, wegen uit de volgende onderdelen: 3,1 g Gamborg's B5 zouten, 0,5 g 2 - (N-morfolino) ethaansulfonzuur zuur (MES, 2,56 mM), 0,75 g calciumchloride-dihydraat (CaCl 2 .2 H 2 O, 6,75 mM), 0,25 g ammoniumnitraat (NH 4 NO 3, 3,12 mM), 136,9 g sucrose (0,4 miljoen). volledig oplossen componenten in ~ 900 ml gedeïoniseerd, gedistilleerd water (DDH 2 O) en breng de pH op 5,7 met een M KOH. Breng uiteindelijke volume van 1 liter en filter steriliseren met een 0,2 um fles-top filter aangesloten op een vacuümpomp.
  2. Verzamel groene, gezonde bladeren van planten (~ 250 ml van de bladeren los verpakt in een bekerglas) en spoel met ~ 40 ml DDH 2 O 4 keer, gevolgd door spoelen tweemaal met steriele DDH 2 O. Met behulp van een # 20 scalpel, gesneden blaadjes in dunne reepjes en verdeel het weefsel even in twee 50 ml steriele plastic buizen. Bereid 1x blad spijsvertering mengsel door toevoeging van 5 ml van 10x blad spijsvertering stockoplossing (10x blad spijsvertering voorraad: los op 2% w / v Macerozyme R-10, 4% w / v Cellulase "Onozuka" R-10 in TEX buffer, filter steriliseren met 0,2 um filter en 5 ml porties invriezen bij -80 ° C) tot 45 ml vers TEX buffer. Voeg ~ 25 ml 1x blad spijsvertering mix per 50 ml tube om alle bladweefsel te dekken.
  3. Vacuüm infiltreren bladweefsel in de spijsvertering mengsel in open buizen voor 1 uur bij kamertemperatuur met behulp van een vacuümexsiccator aangesloten op een waterpomp, gevolgd door 3-uur incubatie bij kamertemperatuur op een rocker met een zacht schudden. Capped buizen met bladweefsel in 1x blad spijsvertering mix worden gehouden gewikkeld in aluminiumfolie tijdens dit proces om blootstelling aan licht te voorkomen.
  4. Na 3 uur, verhoging van de rocker snelheid van ~ 2 minuten protoplasten vrij te geven. Filter de ruwe protoplast schorsing door de twee lagen van steriele kaas doek om vuil te verwijderen en het filtraat verzamelen in een steriele glazen beker. Filter het filtraat door middel van een steriele 100-um mesh nylon in een steriele petrischaal. Verzamel de stroom door en breng het naar een nieuwe steriele 50 ml buis. Gebruik ongeveer 15-20 ml vers TEX buffer om de steriele petrischaal wassen en eventuele protoplasten zich te houden aan het oppervlak te verzamelen.
  5. Centrifugeer de stroom door het gebruik van een schommel emmer rotor op 100xg bij 10 ° C gedurende 15 minuten (Acceleration 6, Deceleration 0).
  6. Verwijder ~ 25 - 30 ml van de vloeistof onder de drijvende protoplast laag, die rest-en gepelleteerd puin bevat, met een steriele 9 "glas Pasteur pipet verbonden met een peristaltische pomp zonder de drijvende protoplast laag en het verlaten van ~ 10 - 15 ml volume.
  7. Voeg verse TEX buffer tot een uiteindelijk volume van 40 ml, terwijl zachtjes resuspenderen de protoplasten.
  8. Herhaal de stappen 2,5 tot 2,7 twee keer zo veel cellulaire vuil te verwijderen mogelijk te maken. De centrifugeertijd wordt teruggebracht tot 10 minuten in de eerste herhaling en tot 5 minuten in de laatste herhaling.
  9. Aspireren drijvende protoplasten met een cut, steriele 1 ml transferpipet naar een nieuwe 15 ml buis. Ga direct naar het sorteren of op te slaan in het donker tot 2 uur bij 4 ° C tot sorteren.

3. Protoplast Sorteren op Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS)

  1. Voor het sorteren, te onderzoeken protoplasten door Confocale Laser Scanning Microscopie (CLSM) met behulp van een 488-nm laser voor excitatie te protoplast integriteit en de aanwezigheid van GFP fluorescentie in de protoplast zwembad te bevestigen. Minimale puin is nodig om te voorkomen verstopping van de FACS-sortering mondstuk.
  2. Sorteer geïsoleerde protoplasten in TEX buffer via FACS (BD FACSVantage SE, BD Biosciences) met behulp van een 200-um mondstuk op een macro soort hoofd event rates tussen 6.000 en 15.000, met een systeem de druk van ongeveer 9 psi na een aangepast protocol 10.
  3. Wild-type niet-GFP protoplasten worden gebruikt om de autofluorescentie drempelwaarden vast te stellen.
  4. Om GFP-positieve protoplasten, een soort cellen met behulp van een luchtgekoelde argon laser (Spectra Physics Model 177, Newport Corporation, Irvine, CA) die worden geëxploiteerd op 100 mW op een 488-nm argon lijn om GFP-fluorescentie te identificeren met behulp van een 530/30 band te verzamelen pass filter.
  5. Na het verzamelen van GFP-positieve protoplasten, onderzoeken gesorteerd protoplasten door CLSM zoals beschreven in stap 3.1.
  6. Extract totaal RNA van gesorteerde protoplasten met behulp van een Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. cDNA kan dan worden voorbereid voor hybridisatie, zoals beschreven in Affymetrix GeneChip Expression Analyse technische handleiding en vervolgens gehybridiseerd met AtH1 Arabidopsis Affymetrix hele genoom van arrays.

Representatieve resultaten

We hebben gedetecteerd een groot aantal GFP-positieve cellen in het GFP-kanaal door FACS (afb. 2). In optimalisatie testen met behulp van GFP enhancer-trap ouders, het constitutief GFP-expressie lijn, J0571, weergegeven ~ 17% tot 24% GFP-positieve protoplasten, terwijl de lijn met vasculaire en dermale expressie, J1071, had ~ 1,4% GFP-positieve protoplasten (tabel 1). Sorteren van 3 x 500 pi (~ 1,5 ml in totaal protoplast schorsing) van J0571 protoplasten gedurende 1 uur gaf ~ 100.000 GFP-positieve protoplasten. Sorteren van 3 x 500 pi (~ 1,5 ml in totaal protoplast schorsing) van J1071 protoplasten gedurende 1,5 uur gaf ~ 3000 GFP-positieve protoplasten. Confocale beelden aangegeven een zeer hoge opbrengst van protoplasten voor zowel de J0571 en J1071 monsters voor sorteren werd uitgevoerd (Fig. 3C en 3E), en de gesorteerde fracties bevatte slechts lichte GFP-fluorescentie protoplasten (Fig. 3G en gegevens niet getoond). Deze bevinding bevestigt dat intact GFP-positieve protoplasten kunnen worden gesorteerd via FACS. De niet-GFP protoplasten kunnen ook worden gesorteerd en verzameld in een apart kanaal. De niet-GFP protoplasten dienen als een ideaal negatieve controle voor latere microarray analyses aan de specifieke veranderingen in genexpressie te detecteren na verlaging van holophytochrome niveaus. RNA-extractie uit geïsoleerde protoplasten (1 ml) geeft RNA van voldoende hoeveelheid voor detectie door fluorospectrometry (afb. 4). Geïsoleerde RNA werd gemeten met een NanoDrop instrument (NanoDrop 1000, Thermo Scientific) en gekwantificeerd door NanoDrop 3.7.1 RNA kwantificatie software. RNA opbrengsten van voorgesorteerd C24 wild-type protoplasten of FACS-gesorteerd, GFP-positieve enhancer trap protoplasten boven het minimum 20 ng die nodig zijn voor gebruik in de RNA-etikettering van assays voor microarray (tabel 2).

Enhancer Trap Line % Van het GFP-positieve protoplasten Aantal gesorteerde GFP protoplasten
J0571 17,18% 24,06% ~ 26.400 ~ 36.000
J1071 ~ 1,43% 1000 ~ 1300

Tabel 1. Percentage van GFP-positieve protoplasten van twee enhancer trap rijen voor het sorteren en het aantal GFP-positieve protoplasten verzameld door het uitvoeren van 500 pi van protoplast schorsing door de Fluorescence Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD).

Plant Line RNA opbrengst (ng)
C24 WT 12.486,5
J0571 60
J1071 71,5

Tabel 2. Opbrengst van de RNA isolatie van protoplasten. RNA werd geïsoleerd uit voorgesorteerd C24 wild-type of gesorteerd GFP-positieve protoplasten van twee enhancer trap lijnen en gekwantificeerd.

Figuur 1
Figuur 1. GAL4 enhancer-trap-op basis van inductie van biliverdine reductase (BVR) expressie in transgene Arabidopsis thaliana planten. (A). Een individuele geselecteerd uit een bibliotheek van GAL4-based enhancer trap lijnen, die een GAL4-responsieve GFP-marker-gen bevatten, kunnen worden gekruist met een regel met een GAL4-responsieve doelwitgen om expressie van het target-gen te induceren in GAL4-bevattende gemarkeerde cellen door de GFP fluorescentie. Op basis van een figuur van Dr Jim Haseloff (http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/geneControl/GAL4Frame.html). (B) De productie van fytochroom chromofoor, phytochromobilin (PΦB) en holophytochrome in ouder lijnen. (C) Links, Vermindering van biliverdine IXα (BV IXα) en PΦB door biliverdine reductase (BVR) activiteit aan BR en PΦR, respectievelijk. BVR activiteit leidt tot uitputting van PΦB en leidt tot een vermindering van de productie van fotoactieve holophytochrome. Rechts, is de reactie gekatalyseerd door BVR getoond.

Figuur 2
Figuur 2. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) overname dot percelen. Vergelijking van de protoplast celsortering voor C24 wild-type (A), J0571 (B) en J1071 (C). (A) Overname dot plot van de niet-fluorescerende GFP C24 wild-type protoplasten opgewekt door een 488-nm argon laser en worden gebruikt om autofluorescentie drempel te bepalen. (B) en (C) het verwerven dot plots tonen proporties van protoplasten die GFP positieve reactie op excitatie door een 488-nm laser. R3 sorteren poorten in B en C af te bakenen van de GFP-positieve doelen die zijn gesorteerd op Fluorescentie-Activated Cell Sorter (FACSVantage, BD) en verzameld. Rode kanaal geeft vAARDEN voor chlorofyl autofluorescentie van protoplasten en groene kanaal geeft waarden voor GFP fluorescentie.

Figuur 3
Figuur 3. Confocale microscopie van plantenprotoplasten gebruikt voor celsortering. Confocale laser beelden van protoplasten gescand voordat (A, C, E) en na (G) sorteren via fluorescentie-Activated Cell Sorter (FACS). B, D, F en H zijn DIC beelden. Protoplasten van de C24 wild type (A, B), J1071 (C, D) en J0571 (E, F, G, H) worden getoond. Afbeeldingen C, E en G zijn samengevoegd beelden van GFP fluorescentie (BP 505 nm - 575 nm) en autofluorescentie (LP 650 nm) verkregen van excitatie met een 488-nm laser. A tot en met H zijn gemiddeld vier scans onder 63x olie. Bar = 10 urn.

Figuur 4
Figuur 4. Kwantificering van RNA geïsoleerd uit protoplasten door fluorospectrometry. RNA geëxtraheerd uit (A) C24 wild type, (B) J0571, en (C) J1071. A geeft RNA voor pre-gesorteerde wild-type protoplasten. B en C geven aan RNA van GFP-positieve protoplasten gesorteerd op Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS). RNA kwantificatie software, NanoDrop 3.7.1, (NanoDrop 1000, Thermo Scientific).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gen expressie profilering door middel van microarrays (1) heeft uitgewezen dat meer dan 30% van de genen in Arabidopsis zaailingen zijn licht gereguleerd 11 en (2) heeft een grote groep genen die coderen voor licht signaaltransductie eiwitten betrokken bij de fytochroom signaalcascade 12, 13 . Dergelijke experimenten suggereren dat licht een snelle en lange-termijn veranderingen in genexpressie induceert. Elke pool van phytochromes mag alleen van een subset van ontwikkelings-en adaptieve reacties. Bovendien is het waarschijnlijk dat stroomafwaarts signaleringscomponenten interactie met phytochromes in een cel-en weefsel-specifieke wijze 2, 14, 15.

De expressie van genen downstream kunnen up-of down-gereguleerd op gerichte BVR expressie. Door middel van een vergelijkende analyse van genexpressie veranderingen in de UAS-BVR X GAL4-GFP nakomelingen en ouderlijnen, kunnen we duidelijke veranderingen in genexpressie, indien dergelijke wijzigingen het gevolg zijn van gelokaliseerde fytochroom tekortkomingen. Op basis van genexpressie profielen, kunnen we genen die negatieve en positieve factoren in fytochroom-gemedieerde cel-cel signalering coderen. Recente data suggereren dat een paar honderd transcripten worden geïnduceerd door protoplasting van plantenweefsel 16. Zo is de ideale negatieve controle voor microarray analyse is RNA geïsoleerd van niet-GFP protoplasten verzameld tijdens het sorteren. Transcripties die worden geïnduceerd door protoplasting van plantaardige weefsel kan worden uitgesloten van data analyse met behulp van deze controles, wat resulteert in de identificatie van doelwit genen die specifiek zijn betrokken bij weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom signalering en / of reacties. Om te bevestigen steady-state veranderingen in de expressie van genen geïdentificeerd met behulp van cel-type-specifieke expressie profilering, kan qRT-PCR worden uitgevoerd op Poly (A) RNA uit de gesorteerde GFP-positieve en GFP-negatieve protoplasten.

Genen waarvan de expressie is sterk veranderd in microarray analyses en bevestigd door qRT-PCR worden geïdentificeerd als kandidaten die betrokken zijn bij discrete fytochroom-gemedieerde intercellulaire signalering. Als T-DNA insertie mutanten zijn reeds beschikbaar in kandidaat-genen, kunnen ze worden geanalyseerd voor licht-gestoorde fenotypes. Door het vergelijken van de fenotypen van mutanten die mutaties in de kandidaat-genen en bekend fytochroom mutanten met wild type, kunnen we specifieke reacties waarin kandidaat-genen hebben regulerende rollen. Als de mutanten met mutaties in kandidaat-genen weer te geven fytochroom-deficiënt fenotype, zal dit bevestigen dat de geïdentificeerde downstream doelwit genen zijn betrokken bij de bemiddeling verschillende fytochroom-gereguleerde reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Werk in de Montgomery lab op fytochroom reacties in planten wordt ondersteund door de National Science Foundation (subsidie ​​niet. MCB-0919100 naar BLM) en de Chemische Wetenschappen, Geowetenschappen en Biosciences Division, Bureau van Basic Energy Sciences, Office of Science, het Amerikaanse ministerie van energie (subsidie ​​niet. DE FG02 91ER20021 naar BLM). Wij danken Melissa Whitaker voor technische bijstand tijdens het filmen en kritisch lezen van het manuscript, Stephanie Costigan voor experimentele bijstand, dr. Louis King voor hulp bij het ontwikkelen en optimaliseren van fluorescentie-Activated Cell Sorting protocollen voor Arabidopsis protoplast sorteren en dr. Melinda Frame voor hulp bij confocale microscopie. Wij danken Marlene Cameron voor grafische vormgeving bijstand en Karen Vogel voor redactionele ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-BVR antibody QED Bioscience Inc. 56257-100
Cellulase “Onozuka” R-10 SERVA Electrophoresis MSPC 0930
Gamborg’s B5 basal salt mixture Sigma-Aldrich G5768
Macerozyme R-10 SERVA Electrophoresis PTC 001
MES, low moisture content Sigma-Aldrich M3671
Murashige and Skoog salts Caisson Laboratories 74904
Phytablend Caisson Laboratories 28302
RNeasy Plant Minikit Qiagen 16419

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Franklin, K. A., Quail, P. H. Phytochrome functions in Arabidopsis development. J. Exp. Bot. 61, 11-24 (2010).
  2. Montgomery, B. L. Right place, right time: Spatiotemporal light regulation of plant growth and development. Plant Signal Behav. 3, 1053-1060 (2008).
  3. Laplaze, L. GAL4-GFP enhancer trap lines for genetic manipulation of lateral root development in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 56, 2433-2442 (2005).
  4. Costigan, S., Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Root-localized phytochrome chromophore synthesis is required for tissue-specific photoregulation of root elongation and impacts sensitivity to jasmonic acid in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
  5. Lagarias, D. M., Crepeau, M. W., Maines, M. D., Lagarias, J. C. Regulation of photomorphogenesis by expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Cell. , 675-688 (1997).
  6. Montgomery, B. L., Yeh, K. C., Crepeau, M. W., Lagarias, J. C. Modification of distinct aspects of photomorphogenesis via targeted expression of mammalian biliverdin reductase in transgenic Arabidopsis plants. Plant Physiol. 121, 629-639 (1999).
  7. Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Detection of spatial-specific phytochrome responses using targeted expression of biliverdin reductase in Arabidopsis. Plant Physiol. 149, 424-433 (2009).
  8. Warnasooriya, S. N., Porter, K. J., Montgomery, B. L. Light-dependent anthocyanin accumulation and phytochromes in Arabidopsis thaliana. , Submitted Forthcoming.
  9. Denecke, J., Vitale, A. The use of protoplasts to study protein synthesis and transport by the plant endomembrane system. Methods Cell Biol. 50, 335-348 (1995).
  10. Birnbaum, K. Cell type-specific expression profiling in plants via cell sorting of protoplasts from fluorescent reporter lines. Nat. Methods. 2, 615-619 (2005).
  11. Ma, L. Light control of Arabidopsis development entails coordinated regulation of genome expression and cellular pathways. Plant Cell. 13, 2589-2607 (2001).
  12. Chen, M., Chory, J., Fankhauser, C. Light signal transduction in higher plants. Annu. Rev. Genet. 38, 87-117 (2004).
  13. Ulm, R., &, N. agy, F, Signalling and gene regulation in response to ultraviolet light. Curr. Opin. Plant Biol. 8, 477-482 (2005).
  14. Ma, L. Organ-specific expression of Arabidopsis genome during development. Plant Physiol. 138, 80-91 (2005).
  15. Neff, M. M., Fankhauser, C., &, C. hory, J, Light: an indicator of time and place. Genes Dev. 14, 257-271 (2000).
  16. Birnbaum, K. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302, 1956-1960 (2003).

Tags

Plant Biology Arabidopsis thaliana confocale microscopie expressie profilering microarray fluorescentie FACS fotomorfogenese fytochroom protoplasting
Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in<em> Arabidopsis thaliana</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warnasooriya, S. N., Montgomery, B.More

Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (39), e1925, doi:10.3791/1925 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter