Summary
Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Désorption Ionisation Mass Spectrometry (MALDI-MS).
Abstract
Cette vidéo montre la préparation d'un ultra-mince de matrice / analyte couche pour analyser des peptides et des protéines par Matrix-Assisted Laser Spectrométrie de masse par désorption ionisation (MALDI-MS) 1, 2. La méthode de la couche ultra-mince implique la production d'une couche de substrat de cristaux de matrice (alpha-cyano-4-hydroxycinnamique) sur la plaque échantillon, qui sert de terrain d'ensemencement pour la cristallisation subséquente d'un mélange matrice / analyte. Avantages de la méthode de la couche ultra-mince par rapport aux autres approches de dépôt de l'échantillon (par exemple goutte séchée) sont qu'il fournit (i) une plus grande tolérance aux impuretés telles que les sels et les détergents, (ii) une meilleure résolution, et (iii) plus l'uniformité spatiale. Cette méthode est particulièrement utile pour la détermination de la masse exacte de protéines. Le protocole a été initialement développé et optimisé pour l'analyse des protéines membranaires et utilisé avec succès pour analyser les canaux ioniques, transporteurs métabolite, et les récepteurs, contenant entre 2 et 12 domaines transmembranaires 2. Depuis la publication originale, elle a également montré pour être tout aussi utile pour l'analyse des protéines solubles. En effet, nous avons utilisé pour un grand nombre de protéines ayant une large gamme de propriétés, y compris ceux avec des masses moléculaires plus élevé que 380 kDa 3. Il est actuellement notre méthode de choix pour l'analyse de masse moléculaire de toutes les protéines. La procédure décrite produit une qualité constante des spectres, et il est sensible, robuste et facile à mettre en œuvre.
Protocol
Il est très important de porter des gants sans poudre lors de la préparation de la couche mince.
Nettoyage de la plaque d'échantillon
- Utiliser une plaque d'acier inoxydable ou en or de l'échantillon MALDI.
- Laver avec du MeOH et essuyer délicatement avec un Kimwipe. Ne pas frotter ou frotter la surface avec le Kimwipe, pour éviter de rayer la surface.
- Laver avec H 2 O et essuyer délicatement avec un Kimwipe.
- Laver avec du MeOH et essuyer délicatement avec un Kimwipe.
- Si nécessaire, répétez MeOH / H 2 O cycle de nettoyage / MeOH, finissant toujours par MeOH.
- Assurez-vous qu'il n'ya pas de taches fantômes ou résidu restant sur la plaque. S'il ya des taches fantômes, rincer la plaque avec de l'eau déminéralisée tout en frottant la surface avec votre main gantée (Ne pas frotter avec Kimwipes). Répétez le MeOH / H 2 O cycle de nettoyage / MeOH.
- Utilisez la plaque immédiatement après le lavage.
Préparation de la solution substrat mince couche
- Mélanger 1 partie de gras saturés 4-HCCA (2 pièces d'ACN, 1 partie d'eau, et 0,1% final TFA) et 3 parties d'isopropanol.
Remarque: La solution fine couche substrat est très stable, et peut être conservé à température ambiante dans l'obscurité pendant un an. Il peut également être conservés à 4 ° C.
Rendre le substrat mince couche
- Appliquer 20-50 pl de la solution de substrat couche mince sur le centre gauche de la plaque, et étaler avec le côté d'une extrémité de la pipette. Balayer dans une direction.
- En séchant, solution, le solvant organique s'évapore très rapidement, laissant derrière de minuscules gouttelettes d'eau sur la surface de la plaque. A ce point, enveloppez votre index avec une nappe de Kimwipe et initialement éponger délicatement la surface de la plaque avec elle.
- Lorsque la surface est libéré de gouttelettes d'eau, essuyez la plaque entière avec uni-directionnel mouvements de balayage en utilisant un Kimwipe.
Remarque: Si la solution ne se propage pas assez de toute la surface de la plaque, d'augmenter la composition d'ACN et de recréer la couche mince. Certains paramètres qui peuvent influer sur la propagation de la solution comprennent l'humidité ambiante et la température.
Remarque: Avec des plaques d'or, la couche apparaît généralement comme un reflet jaunâtre, en fonction de visualisation et d'angles de lumière. Avec des plaques d'acier, seul le bord de la couche est normalement visible. - Nettoyer les bords de la plaque avec un Kimwipe frais avant de le placer dans le support de plaque pour éviter de contaminer la matrice de l'instrument.
Préparation de la solution de matrice
- Saturés 4-HCCA dans FWI (3 parties d'acide formique, 1 partie d'eau, 2 parties d'isopropanol) est recommandé pour l'analyse des deux membranes et les protéines solubles. Il pourrait également être utilisé dans des cas particuliers pour l'analyse des peptides très hydrophobes de grande taille (M> u 4000). Assurez-vous que la solution la matrice utilisée pour repérer les protéines ne dépasse pas ~ 50% de contenu organique, car il dissoudre complètement le substrat en couche mince, défaisant les avantages de la méthode.
Test du substrat mince couche
- 0.5μL spot de la solution de la matrice sur la plaque. Un précipité blanchâtre apparaît à l'interface entre la couche mince et la goutte. Lorsque cette couche recouvre le fond de la gouttelette entièrement, habituellement dans les 10-15 secondes, aspirer l'excès de liquide avec une ligne vide. Si cela prend plus longtemps que 30 secondes pour le précipité se forme, c'est une indication qu'il pourrait y avoir un problème avec le substrat en couche mince et / ou la solution de la matrice.
Exemple d'application
- La concentration de l'analyte dans les solutions de départ devrait être dans les 10 et 1000μM.
- Diluer la solution d'analyte dans la solution de matrice pour une concentration de l'analyte finale entre 0,2 et 2 pm. Par exemple, commencez avec 1 microlitre d'échantillon et de solution 9μl matrice.
Remarque: Assurez-vous que la matrice est proche de la saturation dans la solution finale, sinon vous allez dissoudre le substrat en couche mince.
Remarque: les concentrations d'analyte nécessaire d'obtenir des signaux décent sont très dépendants de la complexité et la solution de composition (par exemple, les contaminants) et ionizability analyte.
Note: Si une dilution en une seule étape ne donne pas de bons résultats, vous devriez essayer une autre étape de dilution. Bien que contre-intuitive, les solutions analyte très concentré produisent rarement de bons spectres.
Remarque: Les protéines membranaires nécessitent généralement plus grandes dilutions. - 0.5μl spot de l'échantillon / matrice de mélange sur la plaque. Un précipité blanchâtre se forme à l'interface entre la couche mince et la goutte. Ce précipité est le co-cristallisation de la matrice et l'analyte. Lorsque cette couche recouvre le fond de la gouttelette entièrement, Usuallié en 10-15 secondes, aspirer l'excès de liquide avec une ligne vide. Si cela prend plus longtemps que 30 secondes pour le précipité se forme, il peut être une indication d'un contaminant présent, ce qui empêche la cristallisation, ou votre analyte est trop concentré.
L'application calibrant
- Préparer le mélange calibrant / matrice d'une manière similaire avec une concentration finale entre 0,1 calibrant-0.5μM.
- Spot 0.5μl calibrant / matrice de mélange sur la plaque à proximité de spots de l'échantillon. Cette proximité physique est utilisée dans une procédure d'étalonnage de pseudo-intérieures dans lequel la plaque est déplacé de l'endroit de l'échantillon à l'endroit calibrant lors de l'acquisition de l'échantillon, pour ajouter un peu de tirs laser de l'calibrants au spectre. Cette approche garantit un calibrage supérieur de masse de précision que l'étalonnage externe seulement.
Étape de lavage
- Lavez chaque spot avec environ 2μL d'une solution froide de la glace 0,1% de TFA aqueux. Aspirer l'excès de liquide avec une ligne vide.
Acquisition des spectres de masse
- Vous êtes maintenant prêt à acquérir des spectres de masse. Si vous utilisez la solution de matrice FWI, vous devez acquérir votre spectres dès que possible pour empêcher la modification irréversible de l'analyte telles que la formylation.
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References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
