Summary
Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS).
Abstract
Dieses Video demonstriert die Herstellung von ultra-dünnen Matrix / Analyt-Schicht für die Analyse von Peptiden und Proteinen durch Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS) 1, 2. Die ultra-dünne Schicht Methode umfasst die Herstellung einer Trägerschicht aus Matrix-Kristalle (alpha-Cyano-4-Hydroxy-Säure) auf die Probe Platte, die als Impfstoff Boden für nachfolgende Kristallisation aus einer Matrix / Analyt-Mischung dient. Vorteile der ultra-dünne Schicht Methode gegenüber anderen Probe Ablagerung Ansätze (z. B. getrocknete Tropfen) sind, dass es (i) sorgt für mehr Toleranz gegenüber Verunreinigungen wie Salzen und Detergenzien, (ii) eine bessere Auflösung, und (iii) eine höhere räumliche Gleichförmigkeit. Diese Methode ist besonders nützlich für die genaue Bestimmung der Masse von Proteinen. Das Protokoll wurde ursprünglich entwickelt und optimiert für die Analyse von Membranproteinen und verwendet werden, um erfolgreich zu analysieren Ionenkanälen, Transportern Metabolit, und Rezeptoren, die zwischen 2 und 12 Transmembrandomänen 2. Seit der ursprünglichen Veröffentlichung, hat sie auch gezeigt werden, gleichermaßen nützlich für die Analyse von löslichen Proteinen. In der Tat haben wir es für eine große Anzahl von Proteinen mit einer breiten Palette von Eigenschaften, einschließlich solcher mit molekularen Massen so hoch etwa 380 kDa 3 verwendet. Es ist derzeit unsere Methode der Wahl für die molekulare Masse Analyse aller Proteine. Die beschriebene Vorgehensweise konsequent produziert hochwertige Spektren, und es ist empfindlich, robust und einfach zu implementieren.
Protocol
Es ist sehr wichtig, puderfrei Handschuhe während der Vorbereitung der dünnen Schicht zu tragen.
Die Reinigung der Probenplatte
- Verwenden Sie einen Edelstahl oder Gold MALDI Probenteller.
- Waschen mit MeOH und wischen Sie vorsichtig mit einem Kimwipe. Nicht reiben oder scheuern die Oberfläche mit dem Kimwipe, um zu verhindern Kratzer auf der Oberfläche.
- Waschen mit H 2 O und wischen Sie vorsichtig mit einem Kimwipe.
- Waschen mit MeOH und wischen Sie vorsichtig mit einem Kimwipe.
- Bei Bedarf wiederholen MeOH / H 2 O / MeOH Reinigungszyklus immer mit der Endung MeOH.
- Stellen Sie sicher, dass es keine Geister Flecken oder Rückstand auf den Teller. Wenn es ghost Spots sind, spülen Sie die Platte mit VE-Wasser, während das Reiben der Oberfläche mit den behandschuhten Hand (nicht mit Kimwipes reiben). Wiederholen Sie die MeOH / H 2 O / MeOH Reinigungszyklus.
- Verwenden Sie die Platte sofort nach dem Waschen.
Vorbereitung der dünnen Schicht Substrat-Lösung
- Mix 1 Teil gesättigte 4-HCCA (2 Teile ACN, 1 Teil Wasser und 0,1% endgültigen TFA) und 3 Teile Isopropanol.
Hinweis: Die dünne Schicht Substrat-Lösung ist sehr stabil und kann bei Raumtemperatur in der Dunkelheit für ein Jahr gehalten werden. Es kann auch bei 4 ° C gelagert werden
Making the dünne Schicht Substrat
- Übernehmen 20-50 ul der dünnen Schicht Substrat-Lösung auf der linken Mitte der Platte, und die Ausbreitung mit der Seite einer Pipettenspitze. Sweep in eine Richtung.
- Da die Lösung trocknet die organische Lösungsmittel verdunstet sehr schnell und hinterlässt winzige Tröpfchen Wasser auf der Oberfläche der Platte. An dieser Stelle, wickeln Sie Ihren Zeigefinger mit einer Lage von Kimwipe und zunächst sanft Blot die Oberfläche der Platte mit ihm.
- Wenn die Oberfläche von Wassertropfen befreit ist, wischen Sie die gesamte Platte mit uni-direktionale geschwungenen Bewegungen mit einem Kimwipe.
Hinweis: Wenn die Lösung nicht genug über die Plattenoberfläche zu verbreiten, die den ACN Zusammensetzung und erstellen Sie die dünne Schicht. Einige Parameter, die die Ausbreitung der Lösung beeinflussen können, zählen Luftfeuchtigkeit und Temperatur.
Hinweis: Mit goldenen Platten, die Schicht in der Regel erscheint als eine gelbliche Reflexion, je nach Betrachtung und Licht Winkeln. Mit Stahlplatten, ist nur der Rand der Schicht in der Regel sichtbar. - Reinigen Sie die Kanten der Platte mit einer frischen Kimwipe, bevor er in den Plattenhalter auf Matrix verunreinigen das Gerät zu verhindern.
Vorbereitung der Matrix-Lösung
- Gesättigte 4-HCCA in FWI (3 Teile Ameisensäure, 1 Teil Wasser, 2 Teilen Isopropanol) ist für die Analyse von Membran und lösliche Proteine empfohlen. Es könnte auch in besonderen Fällen für die Analyse von sehr hydrophoben große Peptide (M> 4.000 u) verwendet werden. Stellen Sie sicher, dass die Matrix-Lösung für die Erkennung der Proteine verwendet nicht mehr als ~ 50% organischer Anteil, da sie komplett auflösen wird die dünne Schicht Substrat, dem Sieg über die Vorteile des Verfahrens.
Test der dünnen Schicht Substrat
- Spot 0.5μL der Matrix-Lösung auf der Platte. Ein weißlicher Niederschlag wird an der Schnittstelle zwischen der dünnen Schicht und die Tröpfchen erscheinen. Wenn diese Schicht den Boden des Tropfens deckt, in der Regel innerhalb von 10-15 Sekunden, saugen die überschüssige Flüssigkeit mit einem Vakuum-Linie. Wenn es länger als 30 Sekunden für den Niederschlag zu bilden nimmt, ist dies ein Zeichen, dass es möglicherweise ein Problem mit der dünnen Schicht Substrat und / oder die Matrix-Lösung sein.
Anwendungsbeispiel
- Die Analytkonzentration in der Startelf Lösungen sollten innerhalb von 10 und 1000μM werden.
- Verdünnen Sie die Analyt-Lösung in Matrix-Lösung, um eine endgültige Konzentration des Analyten zwischen 0,2 und 2 um. Zum Beispiel mit 1μl der Probe und 9μl der Matrix-Lösung beginnen.
Hinweis: Achten Sie darauf, dass die Matrix kurz davor, in die endgültige Lösung gesättigt ist, sonst wirst du abgeblasen, und der dünne Schicht Substrat.
Hinweis: Analytkonzentrationen erforderlich, um menschenwürdige Signale zu erhalten sind stark abhängig von Lösung Komplexität und Zusammensetzung (zB Verunreinigungen) und Analyt Ionisierbarkeit.
Hinweis: Wenn eine einstufige Verdünnung nicht nachgibt gute Ergebnisse, sollten Sie ein anderes Verdünnung versuchen. Obwohl counter-intuitive, hoch konzentrierten Analyten Lösungen nur selten zu guten Spektren.
Hinweis: Membranproteine benötigen in der Regel größeren Verdünnungen. - Spot 0.5μl der Probe / Matrix-Gemisch auf der Platte. Ein weißlicher Niederschlag wird an der Schnittstelle zwischen der dünnen Schicht und die Tropfenform. Dieser Niederschlag ist die Co-Kristallisation von Matrix und Analyt. Wenn diese Schicht den Boden des Tropfens deckt, usuVerbündete innerhalb von 10-15 Sekunden, absaugen die überschüssige Flüssigkeit mit einem Vakuum-Linie. Wenn es länger als 30 Sekunden für den Niederschlag zu bilden nimmt, kann es ein Hinweis auf eine Verunreinigung vorhanden, die Kristallisation verhindert, oder Ihre Analyten zu konzentrieren.
Kalibrierlösung Anwendung
- Bereiten Sie die Kalibrierlösung / Matrix-Mischung in einer ähnlichen Weise mit einer abschließenden Kalibrierlösung Konzentration zwischen 0,1-0,5 um.
- Spot 0.5μl Kalibrierlösung / Matrix-Mischung auf dem Teller in der Nähe der Probe Flecken. Diese räumliche Nähe ist in einem pseudo-interne Kalibrierung Verfahren, bei dem die Platte aus der Probe vor Ort auf die Kalibrierlösung Ort während der Probenvorbereitung Akquisition, um nur einige Laser-Aufnahmen des Kalibrierstandards, um das Spektrum hinzuzufügen bewegt werden. Dieser Ansatz garantiert eine höhere Masse Genauigkeit Kalibrierung als externe Kalibrierung nur.
Waschschritt
- Waschen Sie jeden Ort mit rund 2μL einer eiskalten 0,1% wässriger TFA-Lösung. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem Vakuum-Linie.
Erwerb von Massenspektren
- Sie sind nun bereit, um Massenspektren zu erwerben. Wenn Sie die FWI Matrix-Lösung verwenden, müssen Sie erwerben Ihre Spektren so schnell wie möglich zu irreversiblen Veränderungen an den Analyten wie Formylierung zu verhindern.
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References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
