Summary
Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS).
Abstract
Это видео демонстрирует подготовку ультратонкие матрицы / анализируемого слоя для анализа пептидов и белков Matrix-активированная лазерная десорбция ионизации масс-спектрометрии (MALDI-MS) 1, 2. Ультра-тонкий слой метод включает в себя производство подложки слоем кристаллов матрицы (альфа-циано-4-гидроксикоричных кислота) на образец пластина, которая служит посевом почву для последующей кристаллизации матрицы / аналита смеси. Преимущества ультра-тонкий слой метода по сравнению с другими образец осаждения подходы (например, сухой капли) в том, что он предоставляет (я) большей терпимости к примесей, таких, как соли и моющих средств, (II), более высокое разрешение, и (III), более высоким пространственным единообразия. Этот метод особенно полезен для точного определения массы белков. Протокол был изначально разработан и оптимизирован для анализа мембранных белков и успешно использованы для анализа ионных каналов, метаболит транспортеры, и рецепторы, содержащие от 2 до 12 трансмембранных доменов 2. С первоначальной публикации, он также показал, в равной степени полезны для анализа растворимых белков. Действительно, мы использовали его для большого количества белков, имеющих широкий спектр свойств, в том числе с молекулярной массой выше, чем 380 кДа 3. Текущее время наш метод выбора для молекулярного анализа масса всех белков. Описанная процедура последовательно производит высококачественные спектры, и она чувствительна, надежный и простой в реализации.
Protocol
Это очень важно носить неопудренные перчатки во время подготовки тонким слоем.
Очистка образца пластину
- Использование нержавеющей стали или золота MALDI образец пластины.
- Промыть метанола и осторожно протрите Kimwipe. Не тереть или скраб поверхность с Kimwipe, чтобы не поцарапать поверхность.
- Промыть H 2 O и осторожно протрите Kimwipe.
- Промыть метанола и осторожно протрите Kimwipe.
- При необходимости повторите MeOH / H 2 O / MeOH цикл очистки, всегда заканчивая MeOH.
- Убедитесь в том, что Есть не призрак пятна или остатки, оставшиеся на пластине. Если Есть призрак пятна, промыть пластины с деионизированной водой в то время как трение поверхности с рукой в перчатке (Не трите с Kimwipes). Повторите MeOH / H 2 O / MeOH цикл очистки.
- Используйте пластины сразу после мытья.
Подготовка тонким слоем раствора субстрата
- Смешайте 1 часть насыщенного 4-ГКЦА (2 части АКС, 1 часть воды, и 0,1% окончательный ТФК) и 3 частей изопропанола.
Примечание: тонкий слой раствора субстрата очень стабилен, и может храниться при комнатной температуре в темном месте в течение года. Он также может храниться при 4 ° C.
Создание тонкий слой субстрата
- Применение 20-50 мкл раствора субстрата тонким слоем на левом центре пластины, и распространяются со стороной кончика пипетки. Развертки в одном направлении.
- Как решение высохнет, органический растворитель быстро испаряется, оставляя за собой мельчайшие капельки воды на поверхности пластины. На данный момент, обернуть указательный палец слой из Kimwipe и сначала осторожно промокните поверхность пластины с ним.
- Когда поверхность освобождается от капель воды, протрите все пластины с однонаправленным размашистые движения использованием Kimwipe.
Примечание: Если решение не распространяется достаточно всей поверхности пластины, повысить АКС состав и воссоздать тонким слоем. Некоторые параметры, которые могут повлиять на распространение решения включают влажности и температуры.
Примечание: С золотыми пластинами, слой обычно выглядит как желтовато отражение, в зависимости от просмотра и свет углов. С стальных пластин, только края слоя, как правило, видны. - Чистая края пластины с свежим Kimwipe прежде чем поместить его в пластине держателя для предотвращения матрицы от загрязняющих инструмента.
Приготовление раствора матрицы
- Насыщенные 4-ГКЦА в FWI (3 части муравьиной кислоты, 1 часть воды, 2 части изопропанол) рекомендуется для анализа как мембранные и растворимые белки. Она также может быть использован в особых случаях для анализа очень больших гидрофобных пептидов (M> 4000 и). Убедитесь, что матрица решений для кровянистые выделения белков не превышает ~ 50% органических веществ, как он будет полностью растворяться тонким слоем субстрата, победив преимущества метода.
Испытания тонкий слой субстрата
- Пятно 0.5μL матричного решения на тарелку. Беловатый осадок появится на границе между тонким слоем и капли. Когда этот слой находится на дне капли полностью, обычно в течение 10-15 секунд, аспират избыток жидкости с вакуумной линии. Если она длится более 30 секунд для осадка с образованием, это признак того, что могут быть проблемы с тонкой подложке слой и / или матрица решений.
Пример приложения
- Концентрации аналита в исходных растворов должна быть в пределах 10 и 1000 мкм.
- Развести анализируемого раствора в матричное решение до конечной концентрации аналита от 0,2 до 2 мкм. Например, начните с 1 мкл образца и 9μl матрицы решение.
Примечание: Убедитесь, что матрица близка к насыщенной окончательное решение, в противном случае вы будете растворяться тонкой подложке слой.
Примечание: Аналит концентрации, необходимые для получения достойной сигналов в значительной степени зависит от сложности решения и состав (например, загрязнения) и аналита ionizability.
Примечание: Если пошаговое разведение не приносит хороших результатов, вы должны попробовать другое разбавления шаг. Хотя нелогичным, высоко концентрированные растворы аналита редко приводят к хорошим спектром.
Примечание: Мембранные белки как правило, требуют больших разведениях. - Пятно 0.5μl образца / матрицы смесь на тарелку. Беловатый осадок образует на границе между тонким слоем и капли. Этот осадок сокристаллизации матрицы и аналита. Когда этот слой находится на дне капли полностью, УрГУсоюзника в течение 10-15 секунд, аспират избыток жидкости с вакуумной линии. Если она длится более 30 секунд, осадок на форме, это может быть признаком загрязнения настоящее, которое препятствует кристаллизации, или ваш аналита слишком концентрированным.
Calibrant приложений
- Подготовка calibrant / матрица смеси таким же образом, с окончательным calibrant концентрации между 0,1-0.5μM.
- Пятно 0.5μl calibrant / матрицы смесь на пластину в непосредственной близости от образца пятна. Эта физическая близость используется в псевдо-внутренние процедуры калибровки, в которой пластина перемещается из образцов место для calibrant место во время приобретения образцов, чтобы добавить несколько выстрелов лазерной calibrants к спектру. Этот подход гарантирует более высокую точность калибровки массы, чем внешней калибровки только.
Стиральная шаг
- Вымойте каждого пятна с примерно 2μL из ледяной 0,1% водный раствор TFA. Аспирируйте лишнюю жидкость с вакуумной линии.
Приобретение масс-спектрах
- Теперь вы готовы к приобретению масс-спектров. Если вы используете решение FWI матрицы, необходимо приобрести вашу спектров как можно скорее, чтобы предотвратить необратимые изменения в аналита, таких как формилирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
