Summary
Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).
Abstract
Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS) 1, 2. El método de la capa de ultra-delgada con la producción de una capa de sustrato de los cristales de la matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinámico) en la placa de la muestra, que sirve como terreno de siembra para la cristalización posterior de una mezcla de matriz / analito. Ventajas del método de la capa ultra delgada con respecto a otros métodos de deposición de la muestra (por ejemplo, las gotas secas) es que proporciona (i) una mayor tolerancia a las impurezas tales como sales y detergentes, (ii) una mejor resolución, y (iii) mayor uniformidad espacial. Este método es especialmente útil para la determinación de la masa exacta de las proteínas. El protocolo fue inicialmente desarrollado y optimizado para el análisis de las proteínas de la membrana y se utiliza para analizar con éxito los canales iónicos, transportadores de metabolitos, y los receptores, que contiene entre 2 y 12 dominios transmembrana 2. Desde la publicación original, sino que también ha demostrado ser igualmente útil para el análisis de proteínas solubles. De hecho, lo hemos usado para un gran número de proteínas con una amplia gama de propiedades, incluyendo aquellos con masas moleculares de hasta 380 kDa 3. Actualmente es nuestro método de elección para el análisis de la masa molecular de las proteínas. El procedimiento descrito consistentemente produce espectros de alta calidad, y es sensible, robusto y fácil de implementar.
Protocol
Es muy importante usar guantes sin polvo durante la preparación de la capa delgada.
Limpieza de la placa de muestra
- Use una de acero inoxidable u oro placa MALDI muestra.
- Lavar con MeOH y frote suavemente con un Kimwipe. No frote la superficie con la Kimwipe, para evitar rayar la superficie.
- Lavar con H 2 O y frote suavemente con un Kimwipe.
- Lavar con MeOH y frote suavemente con un Kimwipe.
- Si es necesario, repita MeOH / H 2 O / MeOH ciclo de limpieza, siempre terminando con MeOH.
- Asegúrese de que no hay puntos fantasma o residuo que queda en el plato. Si hay puntos de fantasmas, lavar el plato con agua desionizada mientras se frota la superficie con su mano enguantada (No se frote con Kimwipes). Repita el MeOH / H 2 O / MeOH ciclo de limpieza.
- Use la placa inmediatamente después del lavado.
Preparación de la solución de capa de sustrato fino
- Mezcle una parte de la saturación de 4 HCCA (2 partes de ACN, 1 parte de agua, y el 0,1% final TFA) y 3 partes de isopropanol.
Nota: La solución de capa delgada de sustrato es muy estable y puede mantenerse a temperatura ambiente en la oscuridad durante un año. También se puede almacenar a 4 ° C.
Haciendo que el sustrato de capa fina
- Aplicar 20-50μL de la solución de capa de sustrato fino en el centro-izquierda de la placa, y se extendió con la ladera de una punta de la pipeta. Barrido en una dirección.
- A medida que la solución se seca, se evapora el disolvente orgánico, muy rápidamente, dejando tras de gotas diminutas de agua en la superficie de la placa. En este punto, envuelva su dedo índice con una capa de Kimwipe e inicialmente secar suavemente la superficie de la placa con ella.
- Cuando la superficie esté libre de las gotas de agua, limpie toda la placa con la uni-direccional movimientos de barrido con un Kimwipe.
Nota: Si la solución no se extiende lo suficiente a lo largo de la superficie de la placa, aumentar la composición de ACN y volver a crear la capa delgada. Algunos parámetros que pueden afectar a la difusión de la solución incluyen la humedad ambiental y temperatura.
Nota: Con láminas de oro, la capa por lo general aparece como un reflejo amarillento, dependiendo de la visión y los ángulos de la luz. Con placas de acero, sólo el borde de la capa es visible normalmente. - Limpie los bordes de la placa con una Kimwipe fresca antes de colocarlo en el soporte de la placa para evitar la contaminación de la matriz del instrumento.
Preparación de la solución de la matriz
- Saturado de 4 HCCA en FWI (3 partes de ácido fórmico, 1 parte de agua, 2 partes de isopropanol) se recomienda para el análisis de la membrana y las proteínas solubles. También podría ser utilizado en casos especiales para el análisis de péptidos muy grandes hidrofóbicas (M> 4000 u). Asegúrese de que la solución matriz utilizada para detectar las proteínas no exceda de ~ 50% de materia orgánica, ya que se disolverá completamente en el sustrato de capa delgada, derrotando a las ventajas del método.
Prueba de la capa delgada de sustrato
- 0.5μL lugar de la solución de la matriz en el plato. Un precipitado blanquecino que aparecen en la interfaz entre la capa fina y la gota. Cuando esta capa cubre la parte inferior de la gota por completo, por lo general dentro de 10-15 segundos, aspirar el exceso de líquido con una línea de vacío. Si se tarda más de 30 segundos para que el precipitado a la forma, es un indicio de que podría haber un problema con el sustrato de capa fina y / o la solución de la matriz.
Ejemplo de aplicación
- La concentración de analito en la solución de partida debe ser dentro de los 10 y 1000μM.
- Diluir la solución de analito en la solución de la matriz a una concentración de analito final entre 0,2 y 2μM. Por ejemplo, comience con 1μl de la muestra y 9μl de la solución de la matriz.
Nota: Asegúrese de que la matriz está a punto de saturación en la solución final, de lo contrario será disolver el sustrato de capa fina.
Nota: las concentraciones de analito necesaria para obtener las señales decente dependen en gran medida la complejidad y la solución de composición (por ejemplo, contaminantes) y ionizability analito.
Nota: Si una dilución de un solo paso no da buenos resultados, usted debe tratar de un paso de dilución. Aunque contrario a la intuición, las soluciones de alta concentración de analito rara vez se produce un espectro bien.
Nota: Las proteínas de membrana por lo general requieren grandes diluciones. - 0.5μl lugar de la mezcla de muestra / matriz en el plato. Un precipitado blanquecino que se forman en la interfase entre la capa fina y la gota. Este precipitado es el cocrystallization de la matriz y el analito. Cuando esta capa cubre la parte inferior de la gota por completo, usualiado dentro de 10-15 segundos, aspirar el exceso de líquido con una línea de vacío. Si tarda más de 30 segundos para que el precipitado se forma, puede ser una indicación de la presencia de un contaminante, lo que evita la cristalización, o el analito se concentra demasiado.
Calibrante aplicación
- Prepare la mezcla calibrante / matriz de una manera similar a una concentración final de 0,1-calibrante 0.5μM.
- Lugar 0.5μl calibrante / matriz de mezcla en el plato en las proximidades de los puntos de muestreo. Esta proximidad física se utiliza en un procedimiento de calibración pseudo-interno en el que se mueve la placa desde el punto de muestra hasta el lugar calibrante durante la adquisición de la muestra, para añadir una disparos de láser algunos de los calibradores a todo el espectro. Este enfoque garantiza una calibración de precisión mayor que la masa de calibración externo.
La etapa de lavado
- Lave cada lugar, con aproximadamente 2μL de una helada solución al 0,1% TFA acuoso. Aspirar el exceso de líquido con una línea de vacío.
Adquisición de espectros de masas
- Ahora está listo para adquirir espectros de masas. Si utiliza la solución de la matriz FWI, deberá adquirir el espectro lo más pronto posible para evitar la modificación irreversible de la sustancia analizada como formilación.
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References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
