Summary
Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) ile peptitler ve proteinlerin analizi için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir.
Abstract
Bu video Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon İyonizasyon Kütle Spektrometresi (MALDI-MS) 1, 2, peptidler ve proteinler analiz etmek için bir ultra-ince matris / analit bir tabaka hazırlık göstermektedir. Ultra-ince bir tabaka yöntemi, matris kristalleri bir matris / analit karışımı sonraki kristalizasyon için ekim alanı olarak hizmet veren örnek bir tabak, bir substrat katmanı üretimi (alfa-siyano-4-hydroxycinnamic asit) içerir. Diğer örnek birikimi yaklaşımlar (örneğin kuru damlacık) üzerinden ultra-ince bir tabaka yöntemin avantajları (i), tuzları ve deterjanlar, (ii) daha iyi çözünürlük, ve (iii) yüksek uzaysal tekdüzelik gibi kirleri daha fazla dayanıklılık sağlar. Bu yöntem, proteinlerin doğru kitle belirlenmesi için özellikle yararlıdır. Bu protokol başlangıçta geliştirilmiş ve membran proteinlerin analizi için optimize edilmiş ve başarıyla iyon kanalları, metaboliti taşıyıcılar ve reseptörler analiz etmek için kullanılır, 2 ile 12 transmembran etki alanı 2 arasındaki içeren oldu. Orijinal yayınlandığından beri, aynı zamanda eşit çözünür proteinlerin analizi için yararlı olduğu gösterilmiştir. Gerçekten de, 380 kDa 3 gibi yüksek molekül kitleler de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede, özellikleri olan proteinlerin çok sayıda kullanmıştır. Şu anda tüm proteinlerinin moleküler kitle analizi için tercih edilen bir yöntemdir. Açıklanan prosedür tutarlı, yüksek kaliteli spektrumları üretir ve hassas, sağlam ve uygulanması kolay.
Protocol
Bu ince bir tabaka hazırlanması sırasında pudrasız eldiven giymek çok önemlidir.
Örnek plaka temizliği
- Paslanmaz çelik ya da altın MALDI örnek tabak kullanın.
- MeOH ile yıkayın ve bir Kimwipe hafifçe silin. Yüzeyin çizilmemesi için, Kimwipe yüzey rub veya fırçalayın.
- H 2 O ile yıkayın ve bir Kimwipe hafifçe silin.
- MeOH ile yıkayın ve bir Kimwipe hafifçe silin.
- Gerekirse, her zaman MeOH ile biten MeOH / H 2 O / MeOH temizleme programı tekrarlayın.
- Plaka üzerinde kalan hayalet lekeler veya kalıntı olmadığından emin olun. Hayalet lekeler varsa, eldivenli el (Kimwipes ile ovmak) ile yüzey sürtünme deiyonize su ile plaka durulayın. MeOH / H 2 O / MeOH temizleme döngüsünü tekrarlayın.
- Hemen yıkandıktan sonra plaka kullanın.
Ince bir tabaka substrat çözeltisi hazırlanması
- Doymuş 4-HCCA (2 parça ACN, 1 kısım su,% 0.1 'i son TFA) ve 3 parça izopropanol 1 kısım karıştırın.
Not: ince bir tabaka substrat çözeltisi çok kararlı, ve bir yıl boyunca karanlıkta, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir . Aynı zamanda 4 saklanabilir ° C
Ince bir tabaka substrat
- 20-50μL plakanın merkez sol, ve bir pipet ucu tarafında ile yayılması üzerine ince bir tabaka substrat çözeltisi uygulayın. Tek yönde Sweep.
- Çözüm kurur, çok hızlı bir şekilde organik çözücü buharlaşır, plaka yüzey dakika su damlacıkları geride bırakarak. Bu noktada, bir Kimwipe kat ve başlangıçta ile plaka yüzeyine hafifçe kurulayın işaret parmağınıza sarın.
- Yüzey su damlacıkları serbest olduğunda, bir Kimwipe kullanarak tek yönlü süpürme hareketleri ile tüm plaka silin.
Not: çözüm plaka yüzeyi boyunca yeterince yayılmış değilse, ACN kompozisyon artırmak ve ince bir tabaka yeniden. Çözüm yayılmasını etkileyebilecek bazı parametreler, ortam nem ve sıcaklık içerir.
Not: altın plakalar, tabaka genellikle görüntüleme ve ışık açıları bağlı olarak sarımsı bir yansıması olarak belirir. Çelik plakalar ile, sadece katmanı kenarına normalde görünür. - Matris Cihazı karışmasını önlemek için plaka sahibi yerleştirerek önce taze bir Kimwipe plaka kenarlarını temizleyin.
Matris çözümü hazırlanması
- 4-HCCA Doymuş FWI (formik asit 3 parça, 1 kısım su, 2 parça izopropanol), membran ve çözünür proteinler hem analizi için tavsiye edilir . Çok hidrofobik büyük peptidler (M> 4.000 'u) analizi için, özel durumlarda da kullanılır olabilir. Proteinleri tespit etmek için kullanılan matris çözümü, tamamen yöntemin avantajları yenerek, ince bir tabaka substrat eriyecektir olarak ~% 50 organik içeriği fazla değildir ki emin olun.
Ince bir tabaka substrat Testi
- Plaka üzerinde matris çözüm Spot 0.5μL. Beyaz çökelek, ince bir tabaka ve damlacık arasındaki arayüz görünecektir. Bu katman tamamen damlacık alt kapakları, genellikle 10-15 saniye içinde, bir vakum hattı ile aşırı sıvı aspire. Çökelti oluşturmak için 30 saniye daha uzun sürerse, bu ince bir tabaka substrat ve / veya matris çözümü ile ilgili bir sorun olabileceğine dair bir göstergesidir.
Örnek uygulama
- Başlangıç çözümleri analit konsantrasyonu 10 ve 1000μM içinde olması gerekir.
- 0.2 2μM arasında nihai bir analit konsantrasyonu matris çözümü analit çözüm sulandırınız. Örneğin, örnek ve matris çözüm 9μl 1μl ile başlar.
Not: matris nihai çözüm doymuş yakın olduğundan emin olun, aksi takdirde ince bir tabaka substrat çözülür.
Not: terbiyeli sinyaller elde etmek için gerekli analit konsantrasyonları çözüm karmaşıklığı ve kompozisyon (örneğin, kirleticiler) ve analit ionizability son derece bağımlıdır.
Not: tek bir adım seyreltme iyi sonuç vermezse, bir başka sulandırma adım denemelisiniz. Sezgilere rağmen, yüksek oranda konsantre analit çözümleri nadiren iyi spektrumları üretir.
Not: Zar proteinleri genellikle büyük dilüsyonları gerektirir. - Plaka örnek / matris karışımı Spot 0.5μl. Beyaz çökelek, ince bir tabaka ve damlacık arasındaki arayüz oluşturacak. Bu çökelti matrisi ve analit cocrystallization. Bu katman tamamen damlacık alt kapsar, usu10-15 saniye içinde bir müttefik, bir vakum hattı ile aşırı sıvı aspire. Çökelti oluşturmak için 30 saniyeden daha uzun sürerse, kristalizasyon engeller veya analit çok yoğun olduğu bir bulaşan bir göstergesi olabilir.
Kalibratörü uygulama
- 0.1-0.5μM arasında son kalibratörü konsantrasyon ile benzer bir şekilde kalibrant / matris karışımı hazırlayın.
- Spot 0.5μl kalibrant örnek noktalara yakın plaka / matris karışımı. Bu fiziksel yakınlık plaka spektrumu calibrants birkaç lazer çekim eklemek için örnek satın alma sırasında kalibratörü nokta, örnek noktaya taşınmış olan bir sözde-dahili kalibrasyon prosedürü kullanılır. Bu yaklaşım, sadece harici kalibrasyon daha yüksek bir kütle doğruluğu kalibrasyon garanti eder.
Adım Yıkama
- Buz gibi% 0,1 sulu TFA çözüm yaklaşık 2μL her yerinde yıkayın. Bir vakum hattı ile aşırı sıvı aspire.
Kitle spektrumu Alımı
- Artık kitle spektrumu elde etmek için hazır. FWI matris çözümü kullanıyorsanız formylation olarak analit geri dönüşü olmayan bir değişiklik önlemek için mümkün olan en kısa sürede size spektrumları almanız gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
