Summary
Pms2 और / या पूरे तहखाने में ERCC1 की कम / अनुपस्थित अभिव्यक्ति colonic adenocarcinomas, संभावना उच्च mutability और कैंसर के लिए प्रगति के साथ एक क्षेत्र दोष के आधार के प्रत्येक पक्ष पर एक 10 सेमी के भीतर अक्सर घटना है. Ku86 या CcOI में कमी से कम इन क्षेत्र दोष में लगातार है.
Protocol
तैयारी ऊतकों स्लाइड्स पर देखा जा करने के लिए
- एक colonoscope मलाशय के माध्यम से बृहदान्त्र में पारित किया जा सकता है. Colonoscope एक लंबी ट्यूब है कि रोशनी और सिर पर एक वीडियो कैमरा है, क्षमता बृहदान्त्र में हवा पारित करने के लिए यह एक लंबे समय के लिए बृहदान्त्र के बेहतर दृश्य की अनुमति के गुब्बारे की तरह उड़ा, और बायोप्सी संदंश कर सकते हैं कि के लिए एक मार्ग है वीडियो कैमरा से परे का विस्तार के लिए रवाना भीतरी सतह "त्वचा" या बृहदान्त्र के mucosal परत के एक 3-5 मिलीमीटर क्षेत्र चुटकी करने के लिए हमें एक बायोप्सी नमूना दे. बायोप्सी संदंश भी संभावित पूर्व कैंसर बृहदान्त्र में पाया जंतु को हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- हम सूचित सहमति के साथ रोगियों से सामान्य colonic mucosal ऊतकों की बायोप्सी प्राप्त की. इन रोगियों को एक जठरांत्र क्लिनिक में एक स्क्रीनिंग colonoscopy के दौर से गुजर रहे थे. हमारे बायोप्सी formalin के जार में रखा गया. 4 घंटे के बाद, formalin 70% शराब के द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था.
- इसी तरह के ऊतक के नमूने बृहदान्त्र resections के क्षेत्रों, सर्जरी के दौरान हटा दिया है, कि 1 सेमी और 10 सेमी बृहदान्त्र कैंसर या adenomas के साथ उन्नत रसौली से दूर थे से ले जाया गया. इन ऊतकों के नमूनों में भी formalin रखा गया है, और अगर ऊतकों के नमूनों बड़े थे, कुछ formalin में 70% शराब में रखा जा रहा से पहले एक लंबी अवधि के लिए रखा गया था.
- ऊतकों के नमूनों के लिए एक ऊतक विज्ञान प्रयोगशाला में संसाधित किया जा रहा है और आयल ब्लॉक में रखा ले रहे हैं.
- आयल ब्लॉकों के लिए उन्हें और अधिक आसानी से एक सूक्ष्म तक्षणी द्वारा काट कर फ्रिज में ठंडा कर रहे हैं.
- 4 माइक्रोन मोटाई के ऊतक वर्गों ऊतक ब्लॉक से काट रहे हैं, एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग कर, और पानी पर मंगाई.
- दो प्रोटीन की अभिव्यक्ति ERCC1 और Pms2 उदाहरण के लिए, की तुलना के लिए, वैकल्पिक ऊतक वर्गों को दो स्लाइड्स पर उठाया सकता है, जब तक वहाँ दो स्लाइड्स के प्रत्येक पर तीन ऊतक वर्गों रहे हैं. उदाहरण के लिए, 1 वर्गों, 3, और 5 लेबल ERCC1 और 2 वर्गों, 4 और 6 एक Pms2 लेबल स्लाइड पर रखा जा सकता है है स्लाइड पर रखा जा सकता है. तीन ऊतक वर्गों एक एकल स्लाइड पर एक प्रोटीन के लिए immunostained आप अगर एक तहखाना के एक असामान्य धुंधला पैटर्न एक artifact है या असली है, के बाद से कलाकृतियों एक स्लाइड पर एक से अधिक ऊतक अनुभाग में दोहराया नहीं जाएगा देखने के लिए अनुमति दे सकते हैं. बृहदान्त्र तहखाने व्यास में 60 microns के बारे में में हैं, ताकि के बारे में 15 ऊतक वर्गों एक तहखाना के माध्यम से काटा जा सकता है, और एक ही तहखाना स्लाइड प्रति एकाधिक ऊतक वर्गों पर देखा जा सकता है है.
ऊतक वर्गों Immunostaining
- स्लाइड्स तो immunohistochemical लेबलिंग प्रक्रिया के माध्यम से डाल रहे हैं. यह एक 8 घंटे की प्रक्रिया है, और काफी मानक है. प्रक्रिया है कि हम का उपयोग करें के कुछ हिस्सों, जो मानक नहीं हैं धुंधला के लिए Sequenza कंटेनर के उपयोग, और एक पृष्ठभूमि "निशानाबाज़" कहा जाता धुंधला को कम करने समाधान का उपयोग. "निशानाबाज़" समाधान Biocare मेडिकल, Concord सीए द्वारा एक मालिकाना सूत्र के रूप में बेचा जाता है.
- हमारे प्रक्रियाओं के कदम से कुछ यहाँ दिखाए जाते हैं.
- एक उदाहरण के रूप में, Pms2 immunohistochemistry के लिए, स्लाइड्स xylene के 3 परिवर्तन (3 मिनट प्रत्येक), 2 100% इथेनॉल में परिवर्तन (2 मिनट प्रत्येक), 95% इथेनॉल में 2 परिवर्तन (2 मिनट द्वारा पीछा द्वारा पीछा में रखकर पहले deparaffinized हैं प्रत्येक), आसुत जल के 2 परिवर्तन (2 मिनट प्रत्येक) द्वारा पीछा किया. इन प्रक्रियाओं नकारात्मक हवा के दबाव के साथ एक रासायनिक हुड के अंतर्गत किया जाता है इतना है कि experimenter vapors के संपर्क में नहीं है.
- Formalin जब शुरू करने के लिए ऊतक को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, ऊतक नमूने में प्रोटीन के कुछ हिस्सों पार से जुड़े बन गया. अब हम इतना है कि ब्याज की एक एंटीबॉडी प्रोटीन की पहचान कर सकते हैं पार लिंक को तोड़ने की जरूरत है. स्लाइड जो एक माइक्रोवेव ओवन में एक फोड़ा करने के लिए लाया जाता है एक बफर समाधान में रखा जाता है. यह मध्यम सेटिंग पर 10 मिनट के द्वारा पीछा किया जाता है, बर्फ पर 20 मिनट के लिए ठंडा करने के द्वारा पीछा किया. इस कदम का परीक्षण करने के लिए समायोजित अलग माइक्रोवेव के लिए, जब तक अच्छे परिणाम प्राप्त कर रहे हैं की जरूरत है. ध्यान दें कि CcOI या Ku86 immunostaining के लिए हम एक सोडियम साइट्रेट 9mL साइट्रिक एसिड + 41mL सोडियम साइट्रेट + 450mL एच 2 (सोडियम आयनों एक बफर) हे, जो 6.0 के बारे में पीएच था, ERCC1 के लिए हम साइट्रेट बनाया बफर का इस्तेमाल के साथ किए गए बफर का इस्तेमाल 2.1g साइट्रिक एसिड के साथ + 1 लीटर एच 2 हे + ~ 5ml सोडियम 6.1 (न्यूनतम जोडी सोडियम आयनों के साथ एक बफर) पीएच लाने हीड्राकसीड, और Pms2 के लिए हम एक समाधान 5ml एंटीजन अनमास्किंग (सदिश) के द्वारा समाधान 533mL + के साथ बनाया का इस्तेमाल एच 2 ओ विभिन्न buffers विशेष प्रोटीन epitopes साथ एंटीबॉडी बातचीत को बढ़ाने की जरूरत है.
- स्लाइड्स तो 20 मिनट के लिए 3 मिनट के लिए आसुत पानी में कुल्ला, और फॉस्फेट-buffered खारा में 5 मिनट के लिए धोया (पीबीएस कहा जाता है) द्वारा पीछा कर रहे हैं 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (मेथनॉल में पतला) में डाल दिया.
- स्लाइड्स तो फ्लैट संकीर्ण धुंधला Sequenza (Shandon Sequenza Immunostaining सिस्टम थर्मो वैज्ञानिक से) कहा जाता है रैक में रखा जाता है और पीबीएस के साथ rinsed.
- ERCC1 या Pms2 के लिए immunostained स्लाइड्स तो 10 मिनट के लिए उजागर कर रहे हैंएक मालिकाना समाधान, Biocare से प्राप्त, "निशानाबाज़" कहा जाता है जो पृष्ठभूमि प्रोटीन की गैर विशिष्ट धुंधला कम में कार्य करता है के 3 बूँदें एक जोड़ा इलाज के लिए जोखिम utes है.
- स्लाइड एक बफर TBST "जो 1 मिलीलीटर बीच + 100 मिलीलीटर 10x Tris + 900 मिलीलीटर आसुत जल है [जहां 10x Tris Trizma NaCl + 80 ग्राम + +१००० मिलीलीटर आसुत है और विआयनीकृत + पानी केंद्रित एचसीएल (24.2 ग्राम है के साथ rinsed हैं लगभग 15 मिलीलीटर) 7.6 पीएच] के समाधान लाने के लिए.
- स्लाइड्स तो बफर के साथ तीन बार rinsed, और DAKO के 100 microliters 1:100 कमजोर पड़ने (2% बफर TBST में बना गोजातीय सीरम albumin में) में माध्यमिक एंटीबॉडी biotinylated स्लाइड्स के लिए जोड़ा जाता है और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए incubated.
- इस बिंदु पर, Vectastain एबीसी (Avidin बायोटिन परिसर) (वेक्टर प्रयोगशालाओं से) अभिकर्मक तैयार है, 2.5 मिलीलीटर पीबीएस, 1 ड्रॉप, 1 ड्रॉप समाधान बी समाधान का उपयोग कर, और समाधान के लिए 30 मिनट के लिए खड़े करने की अनुमति दी है.
- स्लाइड्स TBST बफर के साथ 3 बार rinsed हैं.
- फिर Vectastain एबीसी अभिकर्मक के 3 बूँदें जोड़ी जाती है और स्लाइड कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए incubated TBST के साथ 2 बार rinsing द्वारा पीछा कर रहे हैं.
- स्लाइड्स तो के बारे में 5 मिनट के लिए कर रहे हैं थपका (diamino benzamide) (2.9 मिलीलीटर थपका + 400 microliters पीबीएस + 250 microliters हाइड्रोजन पेरोक्साइड) में डूब.
- स्लाइड्स तो आसुत, विआयनीकृत जल के साथ कर रहे हैं 2 बार rinsed.
- Counterstaining hematoxylin के 10 सेकंड के लिए एक पतला समाधान के साथ किया जाता है. स्लाइड्स को अच्छी तरह से नल विआयनीकृत जल के बाद पानी में rinsed हैं.
- स्लाइड्स हैं तो 95% इथेनॉल में 2 मिनट, 100% इथेनॉल और xylene में 2 मिनट के लिए 2 बार में 2 मिनट के लिए 2 बार के लिए निर्जलित 2 बार.
- Cytoseal XYL (वैज्ञानिक रिचर्ड - एलन) की बूंदों के एक जोड़े तो स्लाइड्स के लिए जोड़ रहे हैं और एक coverslip लागू.
- Ku86 ERCC1, और CcOI के immunohistochemical मूल्यांकन Pms2 के लिए के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन एंटीबॉडी के साथ Ku86 ERCC1, और CcOI लिए Pms2 एंटीबॉडी की जगह तालिका में नीचे वर्णित है.
तहखाने ERCC1 की अभिव्यक्ति में कमी है, Pms2, Ku86 और CcOI के लिए ऊतक वर्गों मूल्यांकन
- हम ऊतक वर्गों को पहले Pms2 और colonic mucosa के तहखाने में ERCC1 की अभिव्यक्ति के लिए एक Motic photomicroscope (डीएम BA300) के तहत दिखेगा.
- Pms2 और ERCC1 दोनों डीएनए की मरम्मत एंजाइमों, और इसलिए वे जहां डीएनए तहखाने की कोशिकाओं के नाभिक में स्थित हैं. यह चित्रा 1, जहां भूरे रंग बृहदान्त्र प्रतिनिधित्व ERCC1 के लिए धुंधला हो जाना, एक तहखाना में कोशिकाओं के नाभिक में होता है में संकेत दिया है. सामान्य तहखाना हम खुर्दबीन में पहला शो ERCC1 के लिए दाग किया था, और भूरे रंग के दाग ERCC1 के स्थान से पता चलता है. हम बाहर तहखाने, जहां "जाम कोशिकाओं" एक शराब गिलास की तरह कुछ आकार तहखाना के बाहरी छोर पर कक्षों के आधार पर एक छोटे से क्षेत्र में नाभिक के साथ, और अनुभाग बाहर एक गुब्बारों में कोशिकाओं के प्रकार के बिंदु, तहखाना के अंदर पर सेल के हिस्से में सफेद mucin granules के साथ भरा है. कोशिकाओं के अन्य दो प्रकार के कुछ एक जैसे हमारे दाग वर्गों में, देखो और वे enterocytes और enteroendocrine कोशिकाओं हैं, और उनके नाभिक तहखाना के बाहरी छोर पर भी कक्षों के आधार पर कर रहे हैं. रोगियों जो एक colonic रसौली कभी नहीं था, या पेट के कैंसर के किसी भी साइट से दूर बायोप्सी में लिया बायोप्सी में, लगभग सभी तहखाने में नाभिक के सभी ERCC1 की अभिव्यक्ति की सामान्य उच्च स्तर दिखाने जैसा कि यहाँ दिखाया गया है.
- उन्मुख करने के लिए हमारी टिप्पणियों, ऊतक वर्गों कोई colonic रसौली के साथ रोगियों की बायोप्सी से प्राप्त Pms2 की अभिव्यक्ति के स्तर ERCC1, CcOI या सामान्य colonic mucosa में Ku86 के लिए मनाया जाता है. हम एक सामान्य ऊतकों अनुभाग में सभी तहखाने निरीक्षण, एक 40x उद्देश्य लेंस के साथ कर सकते हैं, जैसा कि हम धीरे धीरे एक पूरे ऊतक और तहखाने, बीचवाला कोशिकाओं, स्लाइड पर किसी भी lymphoid पिंड, और पेशीकला बाहर बिंदु अनुभाग के माध्यम से जाना (यदि मौजूद बायोप्सी में).
- हम यह भी कहना है कि वहाँ सिर्फ तहखाना जो स्टेम कोशिकाओं के आधार पर कई कोशिकाओं रहे हैं. इन स्टेम कोशिकाओं पूरा तहखाना के बारे में 2000 कोशिकाओं के सभी उत्पन्न करते हैं. एक उत्परिवर्तन या एक epimutation के साथ एक स्टेम सेल पूरे स्टेम सेल आला पर ले जा सकते हैं. फिर पूरे तहखाना ब्याज की एक एंजाइम (तहखाना रूपांतरण) के लिए धुंधला हो जाना के रूप में हम इस नए स्लाइड शो में जहाँ हम पूरे तहखाने CcOI तहखाने है कि CcOI की उच्च अभिव्यक्ति के लिए अगले के लिए कमी देखते हैं परिवर्तित हो सकता है है.
- तो फिर हम एक मरीज से पेट के कैंसर या उन्नत रसौली के साथ एक ग्रंथ्यर्बुद के साथ एक स्लाइड शो. इस स्लाइड पर, कुछ तहखाने ERCC1 के लिए अभिव्यक्ति की सामान्य उच्च स्तर है और कुछ अभिव्यक्ति की निचले स्तर पर है. ऊतक अनुभाग के भीतर तहखाने के सभी एक 10x उद्देश्य लेंस के साथ कम संकल्प पर फोटो खिंचवाने कर रहे हैं, और छवियों को इतना है कि पूरे ऊतक खंड एक छवि में देखा जाता है टाइलों रहे हैं. तहखाने तो गिने जा रहे हैं.
- एंजाइम की उच्च अभिव्यक्ति के साथ तहखाने, बायोप्सी में दूर fro तहखाने के विशिष्टकिसी भी कैंसर मीटर, स्तर "4" धुंधला कहा जाता है. , "2" अन्य स्तरों रहे हैं "0" अगर वहाँ कोई detectable अभिव्यक्ति है, "1" अगर अभी मुश्किल detectable अभिव्यक्ति स्पष्ट है अगर वहाँ अभिव्यक्ति मौजूद है, लेकिन 4 स्तर की तुलना में एक बहुत कम स्तर, और "3" पर अगर अभिव्यक्ति है 4 से कम स्तर पर मौजूद है, लेकिन काफी मजबूत है. हम 4 के लिए कम संकल्प छवि नीले पर प्रत्येक स्लाइड, 1 के लिए 3 के लिए 2 के लिए हरे, पीले, नारंगी और 0 के लिए लाल डॉट. यहाँ हम एक 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर एक बायोप्सी से एक अनुभाग के माध्यम से जा रहा दिखाओ. हम कम संकल्प छवि पर तहखाने डॉट.
चित्रा 1 तहखाना कोशिकाओं के नाभिक में एक colonic ERCC1 के उच्च अभिव्यक्ति दिखा तहखाना. इस छवि में सभी रंग समान रूप से इसके विपरीत है और संतृप्ति में बढ़ाया गया था, का उपयोग पेंट शॉप प्रो 5.
प्रतिनिधि परिणाम
- अलग - अलग स्लाइड्स पर वैकल्पिक ऊतक वर्गों हमें वही colonic तहखाने में देखने के लिए दो अलग immunohistochemistry द्वारा दिखाए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ, अनुमति देते हैं. ERCC1 लिए Pms2 के लिए तहखाना सना हुआ और उसी तहखाना दाग की छवि आसन्न कंप्यूटर पर नज़र रखता है के साथ सटे सूक्ष्मदर्शी पर दिखाया गया है. यह निर्धारित करने के लिए हमें की अनुमति देता है कि क्या वहाँ दो प्रोटीनों के लिए या प्रोटीन के प्रत्येक में कमी चाहे संयुक्त कमी है, जबकि प्रत्येक अक्सर है, स्वतंत्र होता है है. हम तीन स्लाइड प्रति ऊतक वर्गों है, इसलिए है कि एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति में कोई स्पष्ट कमी एक से अधिक अनुभाग पर कमी किया जा रहा है, और नहीं एक artifact के कारण के रूप में सत्यापित किया जा सकता. बृहदान्त्र कैंसर, जहां एक क्षेत्र कैंसर को जन्म दे दोष है आसपास के ऊतकों में, वहाँ ERCC1 और Pms2 के लिए कमी तहखाने के एक उच्च आवृत्ति है.
- हम भी immunohistochemistry प्रयोग किया जाता है Ku86 और CcOI के लिए कमी तहखाने की आवृत्ति खोजने के. इस स्लाइड पर, हम एक पूरे ऊतक अनुभाग immunostained Ku86 के लिए, एक 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर के माध्यम से जाओ, और हम देख सकते हैं कि कुछ तहखाने में इस ऊतक अनुभाग के लिए Ku86 कमी हैं.
- इसी प्रकार, इस स्लाइड पर, हम एक पूरे ऊतक अनुभाग immunostained CcOI के लिए, एक 40x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर के माध्यम से जाओ, और हम देख सकते हैं कि केवल तहखाने के एक मध्यम संख्या CcOI के लिए कमी है.
Discussion
- 3 स्लाइड प्रति ऊतक वर्गों है यह बहुत महत्वपूर्ण है. बुलबुले जब मीडिया एंटीबॉडी ले जाने को लागू होते हैं, ताकि कुछ तहखाने के तहखाने या भाग पर्याप्त नहीं किया जा दाग सिर्फ इसलिए कि एक बुलबुला ऊतक अनुभाग के साथ प्रतिक्रिया से एंटीबॉडी रोका सकता है. तहखाने हैं व्यास में 60 microns के बारे में में, और ऊतक वर्गों 4 मोटी microns हैं, तो वहाँ के रूप में कई के रूप में 15 ऊतक वर्गों वही तहखाना के माध्यम से किया जा सकता है. यह आमतौर पर के लिए एक ही तहखाना मिल संभव है, एक गाइड के रूप में कई ऊतक एक स्लाइड पर रखा वर्गों पर तहखाना की आकारिकी, का उपयोग.
- हमारे हाल ही के अध्ययन में, बड़े ऊतकों के नमूनों के लिए, एक Sequenza में धुंधला हो जाना अच्छा एंटीबॉडी के ऊतकों को कवरेज नहीं दे सकता. इन मामलों में, एक ऊतक के हाथ धुंधला हो जाना है, जहां एंटीबॉडी युक्त मीडिया की एक बूंद प्रत्येक ऊतक नमूने पर हाथ रखा जाता है का उपयोग करने के लिए पसंद कर सकते हैं.
- स्पष्ट रूप से भूरे रंग धुंधला दिखाने immunostained प्रोटीन, और नीले परमाणु डीएनए कंप्यूटर मॉनीटर पर दिखा धुंधला की अभिव्यक्ति देखते हैं, Motic photomicroscope सॉफ्टवेयर निम्नानुसार निकाला जाता है: 0 लाभ, 0 ऑफसेट, 255, 0, बढ़ाएँ, गामा 1.00, 0, 1 सुस्पष्टता, रंग सुधार 7, आर, जी, बी 1.00 लाभ, और आर, जी, बी 0 चमक. संकल्प 1024 768 एक्स पर सेट है, और श्वेत संतुलन सक्षम है.
- हमारे विधि के साथ किसी भी प्रोटीन पेट के कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण हो सकता है सोचा इस्तेमाल किया जा सकता है, की कमी के अपने आवृत्ति का आकलन करने के लिए, या संभवतः overexpression, उन्नत रसौली के साथ बृहदान्त्र कैंसर या adenomas के आसपास के क्षेत्र दोष में.
- फील्ड दोष कैंसर के लिए प्रगति का एक हिस्सा हैं
शब्द "क्षेत्र cancerization" पहले वध एट अल द्वारा इस्तेमाल किया गया था 1 1953 में उपकला के एक क्षेत्र या "क्षेत्र" है कि बड़े पैमाने पर अज्ञात प्रक्रियाओं (समय) के द्वारा किया गया preconditioned है इतनी के रूप में यह कैंसर के विकास की ओर संभावना अधिक होती है का वर्णन करने के लिए. प्रारंभिक उपयोग मौखिक कैंसर के संदर्भ में था. तब से, शब्द "क्षेत्र cancerization" और "क्षेत्र दोष" और अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है किसी भी पूर्व घातक ऊतकों में जो नए कैंसर को पैदा होने की संभावना है का वर्णन है, और नैदानिक ऑन्कोलॉजी में क्षेत्र cancerization की अवधारणा बढ़ती ध्यान 2 प्राप्त हुआ है . हमने हाल ही में गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर में 3 क्षेत्र दोष के लिए साक्ष्य की समीक्षा की . इस समीक्षा में शामिल थे एक दर्जन बृहदान्त्र में क्षेत्र दोष के सबूत उपलब्ध कराने के अध्ययन के परिणाम है.
Colonic mucosa में फील्ड दोष शायद इस तरह के एक तहखाना की स्टेम कोशिकाओं के बीच उत्परिवर्ती या कक्षों epigenetically बदल कोशिकाओं के प्राकृतिक चयन के द्वारा उठता है कि एक स्टेम सेल आला उत्तराधिकार 4 बचता है. जेनेटिक अस्थिरता या एक mutator phenotype, शायद डीएनए nucleotide काटना की मरम्मत या बेमेल मरम्मत के डीएनए की कमी के कारण, इस प्रक्रिया में तेजी लाने के (और Pms2 में अक्सर दोष पहले बृहदान्त्र 5 कैंसर आसपास के क्षेत्रों में सूचना मिली थी). अगर, colonic mucosa में स्टेम कोशिकाओं की सामान्य आबादी में, एक सेल में एक परिवर्तन या एक epimutation के माध्यम से एक चयनात्मक लाभ प्राप्त है, यह पड़ोसी स्टेम कोशिकाओं की कीमत पर clonally विस्तार करते हैं जाएगा. Colonic mucosa में, स्टेम सेल आला ≤ 5 6 कोशिकाओं जो तब सब (लगभग 2,000) जन्म तहखाना की कोशिकाओं दे द्वारा कब्जा कर लिया है. एक "तहखाना रूपांतरण" 7 में एक उत्परिवर्ती या epigenetically बदल सेल प्रकार के परिणाम के द्वारा स्टेम सेल आला के ऊपर ले.
उत्परिवर्तित क्लोन colonic उपकला में फैल (परिवर्तित तहखाने) सबसे अक्सर तहखाना 8 विखंडन के द्वारा हो सकता है . तहखाना विखंडन का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. इस तरह असामान्य ऊतक के एक पैच उठता है. इस तरह के एक पैच के भीतर, एक दूसरे जैसे उत्परिवर्तन होते इतना है कि एक तहखाना दिया पैच के भीतर अन्य तहखाने की तुलना में एक लाभ प्राप्त है, और इस तहखाना clonally एक माध्यमिक पैच बनाने मूल पैच के भीतर का विस्तार होगा हो सकता है. इस नए पैच के भीतर, इस प्रक्रिया को कई और अधिक समय दोहराया जा सकता है, शायद दशकों में, जब तक एक घातक स्टेम सेल पैदा होती है जो clonally एक कैंसर में फैलता है. यदि यह सामान्य प्रक्रिया है जिसके द्वारा छिटपुट colonic adenocarcinomas उठता है, तो colonic adenocarcinomas आम तौर पर के साथ जुड़ा हुआ होना चाहिए, और, विषमता के क्षेत्र पहले. इस प्रकार परिवर्तित तहखाने के एक पैच के क्षेत्र में detectable दोष उन्नत रसौली के साथ एक ग्रंथ्यर्बुद के आसपास, या पेट के कैंसर के आसपास है उम्मीद की जा सकती है.
पूर्व ट्यूमर प्रगति के इस मॉडल से, एक आनुवंशिक या epigenetic परिवर्तन ऊतक गैर neoplastic बृहदान्त्र के neoplastic घावों के आसपास के क्षेत्रों में है कि कैंसर के लिए प्रगति की संभावना कर रहे हैं में colonic mucosa से ली गई नमूनों के बीच पूर्व ट्यूमर प्रगति से संबंधित खोजने के लिए उम्मीद करेंगे . विशेष रूप से, डीएनए की मरम्मत एंजाइमों में, या apoptosis के लिए आवश्यक प्रोटीन में दोष जीनोमिक अस्थिरता बढ़ाने के द्वारा प्रगति में योगदान है, और एक दोषपूर्ण क्षेत्र में पाया जा उम्मीद की जा सकती. - Pms2 में कमी के लिए चयन जब कोशिकाओं घ हैंERCC1 लिए eficient और एक डीएनए हानिकारक एजेंट के अधीन
नारा एट अल 9 चीनी हम्सटर अंडाशय की कोशिकाओं के 25 संस्कृतियों 43 3B, एक डीएनए की मरम्मत ERCC1 जीन निष्क्रिय उत्परिवर्तन के साथ सभी वृद्धि हुई है, और एक डीएनए हानिकारक एजेंट के साथ इलाज संस्कृतियों, MNNG . डीएनए की क्षति के उपचार जीवित कोशिकाओं के अलावा, किसी एकल कक्ष प्रत्येक संस्कृति से पृथक किया गया और एक क्लोन के रूप में की अनुमति दी. सभी अलग क्लोन के बारे में 10 गुना अधिक माता पिता तनाव की तुलना में MNNG द्वारा हत्या के लिए प्रतिरोधी रहे थे. अलग क्लोन, 22 डीएनए बेमेल मरम्मत (एमएमआर) में दोषपूर्ण साबित हो गया है. पाँच इन 22 क्लोनों के अनुक्रमण द्वारा परीक्षण किया गया, और तीन से पाँच Pms2 के लिए कमी थी. Pms2 में दोष के लिए यह चयन संभाव्यतः था क्योंकि Pms2 कमी apoptosis के प्रतिरोध के कारण, और इसलिए जोडी डीएनए कोशिकाओं में शेष जब ERCC1 अनुपस्थित था नुकसान जीवित रहने की क्षमता है. (आम तौर पर, Pms2 इंद्रियों डीएनए की क्षति स्तर, और कोशिकाओं का कारण बनता को apoptosis से गुजरना जब डीएनए की क्षति अत्यधिक है.) इस प्रकार, Pms2 में एक कमी है जब ERCC1 की कमी कोशिकाओं में डीएनए की क्षति के अधीन कर रहे हैं के लिए चुना है. दोनों ERCC1 और Pms2 में दोषपूर्ण क्लोन करने के लिए एक 500 से 1000 गुना अधिक से अधिक उत्परिवर्तन की दर के बारे में दिखाया गया है, जब माता - पिता की कोशिकाओं की तुलना में यूवी के साथ विकिरणित. - पित्त अम्लों oxidative तनाव के कारण, डीएनए हानिकारक एजेंट हैं और पेट के कैंसर की प्रगति में महत्वपूर्ण हैं
Deoxycholic अम्ल, पित्त अम्ल, 10 mitochondria के हानिकारक सहित कई प्रक्रियाओं द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) की पीढ़ी के माध्यम से oxidative तनाव बढ़ जाता है. हाल ही में सबूत है कि ROS epigenetic 11 बदलाव का कारण है, और कम से कम 15 अध्ययनों से पता चला है कि पित्त अम्लों, वृद्धि की सांद्रता के साथ एक उच्च वसा वाले आहार पर, डीएनए 12 नुकसान का कारण है. के रूप में Bernstein एट अल द्वारा की समीक्षा 12. आहार वसा की खपत और पेट के कैंसर की घटनाओं के बीच एक सकारात्मक सहयोग है. आंत्र पथ में पित्त अम्लों आहार में वसा के जवाब में secreted रहे हैं, और पित्त अम्लों कार्य डिटर्जेंट के रूप में वसा के पाचन में सहायता करने के लिए. इस प्रकार, एक उच्च वसा आहार वृद्धि पित्त अम्ल स्राव के साथ जुड़ा हुआ है. मलीय पित्त अम्ल की सांद्रता बृहदान्त्र कैंसर के एक उच्च घटना के साथ आबादी में बुलंद कर रहे हैं, और पित्त अम्लों के लिए अत्यधिक जोखिम 13 carcinogenesis बृहदान्त्र के लिए एक बड़ा जोखिम कारक के रूप में माना जाता है. पित्त अम्लों बृहदान्त्र में क्षेत्र दोष के कारण हो सकता है.
चित्रा 2 3 तहखाने में एक colonic तहखाना fissioning.
निष्कर्ष
हम डीएनए की मरम्मत ERCC1 और Pms2 बृहदान्त्र कैंसर के आसपास के बड़े क्षेत्र में दोषों जीन (Pms2 भी apoptosis के लिए आवश्यक है) में कमी तहखाने के एक उच्च आवृत्ति पाया. ERCC1 और Pms2 (epigenetic परिवर्तन या परिवर्तन करने के लिए कारण) में कमी पेट के कैंसर के लिए प्रगति के लिए केंद्रीय आनुवंशिक अस्थिरता में प्रारंभिक कदम हो सकता है.
Acknowledgments
दक्षिणी एरिज़ोना दिग्गजों मामलों स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली वीए मेरिट समीक्षा अनुदान 0142 और एरिजोना जैव चिकित्सा अनुसंधान अनुदान आयोग 0803 द्वारा प्रदान की अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMS2 antibody | BD Biosciences | 556415 | |
| ERCC1 antibody | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-671-P1 | |
| Ku86 antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9034 | |
| CcO1 antibody | Invitrogen | 459600 | |
| Biotinylated secondary | Dako | E0413 | |
| 22% BSA | Informagen, Inc. | 2327 | |
| Sniper | Biocare Medical | BS966 | |
| Vectastain ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 34001 | |
| Tween 20 | USB Corp., Affymetrix | 20605 | |
| Cytoseal XYL | VWR international | 48212-196 | |
| Trizma | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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