Summary
Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di sviluppo
Abstract
Molte proteine svolgono un duplice ruolo nello sviluppo embrionale. Quelle che regolano il destino determinazione delle cellule in un tessuto specifico può anche influenzare lo sviluppo di una regione più ampia dell'embrione. Questo rende la definizione del suo ruolo in un tessuto particolare difficile da analizzare. Per esempio,
Protocol
Parte I. Set-up per l'analisi ACT
- Generare RNA ricoperto per iniezione come suggerito dal produttore, usando il loro fenolo: cloroformio metodo di purificazione (es. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA che codifica per una proteina fluorescente viene usato come tracciante. Trascriviamo sia proteina fluorescente gialla (YFP) o mCherry 5 cDNA, che si trova in un vettore di espressione pCS2 +.
- Tirare tubi in vetro borosilicato capillari per formare punte di vetro affusolata con un estrattore micropipetta. Noi usiamo Sutter Micropipetta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), come descritto in precedenza 6.
- Fai soluzioni sterili nella tabella 1 da 10 X Marc modificato Ringer (MMR), soluzione madre (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 HEPES mM, 1 M di NaCl, a pH 7,5, autoclave e conservati a RT).
- Isolare testicoli da una rana maschio e conservare il tessuto a 4 ° C in una soluzione sterile di 1X MMR / gentamicina (50 mg / ml di gentamicina solfato; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Questo può essere fatto fino ad una settimana prima dell'inizio dell'esperimento, ma è perde la sua efficacia nel tempo.
- Soluzione di deposizione delle uova (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mm Trizma base, 2,62 mM NaHCO 3 e 2,75 mM MgSO 4; portato a pH 7,6) può essere fatto come uno stock 8X, che può essere conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. Nota: attenzione per la contaminazione in questa soluzione, in quanto questo influenzerà la qualità della vostra uova.
- Genera piastre iniezione. Per fare questo, si fondono l'1% di agarosio a 0.4X MMR in un forno a microonde, aggiungere ~ 6 ml di soluzione fuso agarosio in 60 piastre mm, delicatamente srotolare uno stampo in elastomero (Figura 1) sulla parte superiore della soluzione per evitare bolle e lasciate raffreddare per circa 20 minuti a RT. Per determinare il numero necessario, considerare il numero di condizioni sperimentali (ad esempio 1, YFP, 2, YFP Noggin +) e il numero di embrioni ospitare trapiantato necessario. Per i nostri esperimenti, abbiamo generare almeno 20 embrioni ospitare trapiantati per ogni condizione sperimentale. A 18-19 ° C, gli embrioni saranno allo stadio 15 per circa un'ora. Se ci vuole un'ora per effettuare 20 trapianti, poi due punti di tempo fecondazione sono necessari, assumendo gli embrioni ospitare accettare tutti i trapianti. Pertanto, quattro piatti di iniezione saranno necessari (2 condizioni x 2 punti exp tempo fecondazione = 4). Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di una settimana.
- Genera piastre di isolamento tappo utilizzando 1% di agarosio + 0,7 X MMR con stampi come per la piastra di iniezione. Fai lo stesso numero di isolamento cap come piastre di iniezione più uno per ogni punto temporale fecondazione (4 + 2 punti di tempo fecondazione = 6).
- Iniettare femmine con 500 unità di gonadotropina corionica umana alla fine della giornata il giorno prima microiniezione. Donne conservare a 16-18 ° C durante la notte.
Parte II. Microiniezione RNA di embrioni di Xenopus laevis
A. Preparazione per la microiniezione
- Rimuovere femminile ormonale indotta e metterli nei singoli serbatoi contenenti 1X soluzione la deposizione delle uova (ELS). Nota: non usare le uova che sono state in ELS più di due ore come la qualità delle uova è ridotta. Pertanto, circa un'ora prima fecondazione in vitro, abbiamo scartare tutte le uova dal serbatoio in modo che solo uova fresche di cui sono raccolti.
- Preparare l'ago per microiniezione dal tagliando la punta per ottenere un diametro di 25-35 micron. Posizionare l'ago sulla picoinjector e calibrare in modo che esso eroga 10 Nl per iniezione.
- Impostare un incubatore a 14 ° C.
- Una volta che le femmine hanno deposto le uova per circa un'ora, togliere le uova dal serbatoio con una pipetta di trasferimento e di inserirli in piatti mm 60 Petri. Rimuovere il ELS molto dalle uova possibile e sostituirlo con 1X MMR. Le uova possono essere fecondate subito o rimanere in MMR 1X per un massimo di un'ora. Per l'analisi dei trapianti, è meglio fertilizzare due piatti, 80% di occupazione di un singolo strato di uova in un massimo di tre lotti separati verso le 11 del mattino, mezzogiorno e 1 pm. Dopo l'iniezione, che verranno messi a 14 ° C in modo che si svilupperà per le fasi desiderato per l'isolamento tappo (stadio 8,5-9) e il trapianto (stadio 15; vedere la Parte I, # 6).
- Per verificare la qualità dei testicoli, facciamo una fecondazione mattina presto (~ 8 del mattino), che ci permette di estrarre i testicoli di un altro maschio, se lo sperma dalla prima non è praticabile. Nota: abbiamo omogeneizzare ~ 0,25 testicoli in 1 ml 1X MMR e aggiungere circa 5-7 gocce per piastra di ovociti.
- In vitro fertilizzare le uova con testicoli omogeneizzato e, un'ora dopo, togliere il cappotto gelatina sulle uova con de-gelatina soluzione (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 fino a 50 ml di acqua Nanopure autoclavata). Attendere fino a raggiungere stadio di due cellule per iniziare l'ordinamento, che dura circa 2 ore a 18 ° C o 1,5 ore a temperatura ambiente (22 ° C).
- Utilizzando un trasfer pipetta, gli embrioni sorta uniformemente pigmentate e uniformemente dividendo, come mostrato nella calotta animale abbia lasciato in Figura 3, nel pozzo di un piatto pieno di iniezione Ficoll 0.4X MMR + 6%.
B. Microiniezione
- Stretch Parafilm sopra la parte superiore di un 60 millimetri coperchio Petri. Pipettare 2 ml di tuo primo campione di RNA sul Parafilm ed aspirare con il PLI-100 per riempire il vostro ago per l'iniezione. Assicuratevi di controllare che l'ago sia ancora erogazione nL 10 del campione prima di iniziare l'iniezione.
- Iniettare 20-30 a due cellule embrioni stadio (entrambi blastomeri) con 500 pg YFP RNA in un piatto e il tuo gene di interesse (ad esempio 20 pg Noggin RNA) più YFP RNA in un altro piatto 7.
- Luogo 100-200 non per iniezione embrioni per ogni punto ora in un altro piatto di iniezione con la soluzione di Ficoll. Muoversi dentro e fuori dell'incubatore, allo stesso tempo come gli embrioni iniettati. Questi sono i padroni di casa per essere utilizzato nella parte IV.
- Dopo l'iniezione, tutti gli embrioni incubare a 14 ° C durante la notte. Ripetere l'operazione per tutti i punti di tempo.
Parte III. Isolare tappi animale da embrioni iniettati
- Arrivo la mattina presto per mettere in scena gli embrioni. Il punto di primo tempo dovrebbe essere in fase 9. Rimuovere quelli che non sono sopravvissuti. Procedere con le seguenti operazioni di lavoro con ogni punto di volta in lotti.
- Eliminare la soluzione di Ficoll da ogni piatto e aggiungere MMR posteriore 0,7 X / soluzione di gentamicina. Per un piatto di isolamento del tappo, aggiungere una generosa quantità di 0,7 X MMR / gentamicina soluzione. Sloggiare embrioni da pozzi di iniezione loro piatto con una pipetta di trasferimento e posto nel piatto tappo appena preparato isolamento.
- Isolare tappi animale in 0,7 X MMR soluzione + gentamicina, mantenendo 2 o 3 embrioni intatti per la stadiazione. O il Gastromaster, munito di una punta giallo piegato a 400 micron, o un paio di pinze taglienti numero 5 può essere utilizzato.
- Mettere cappucci indietro nel 14 ° C incubatore fino al giorno successivo. Gli embrioni host deve essere rimosso dal termostato al tempo stesso i tappi per tenerli nella stessa fase di sviluppo come il tessuto del donatore.
Parte IV. Il trapianto di tappi sul fianco
- Togliere i tappi e gli embrioni dal punto prima volta dal 14 ° C incubatore e lo stadio degli embrioni. Ordina per uniforme di colore giallo o rosso fluorescente-positivi tappi, a seconda del tracciante iniettato (Figura 2).
- Contare il numero di tappi e rimuovere raddoppiare il numero di embrioni stadio 12-13 per un piatto di iniezione preparati al momento con 0,7 X MMR / soluzione di gentamicina. Con forte pinze # 5, rimuovere la membrana vitellina da ciascuno. Trasferirli alla piastra con i tappi, ma state attenti. Senza il loro membrana vitellina, gli embrioni possono dissociare rapidamente sulla superficie dell'acqua.
- Utilizzando il gastromaster (punta gialla, 200-250μm filo piegato, impostazione più elevata) o # 5 pinzette, rimuovere un 200 micron quadrato sul lato di un embrione allo stadio 14-15 (Figura 3). Poi, tagliate un cappuccio a metà (con il gastromaster o la # 5 forcipe) e posizionare il tessuto nel foro praticato nel embrione ospitante. Ruotare l'embrione contro il bene di permettere la guarigione. Fate questo per gli embrioni che puoi mentre sono in fase 15. Ripetere l'operazione per tutti i punti di tempo.
- L'embrione di solito guariscono in 30 minuti. Rimuovere le cellule morte (bianco) con un delicato movimento spazzolatura con una pinza # 5. Farle crescere a 18 ° C durante la notte.
- Sotto il microscopio a fluorescenza dissezione, degli embrioni sorta con fluorescenza marcata, tessuto trapiantato. Rimetterli a 18 ° C a crescere fino allo stadio 42-43.
- Anestetizzare gli animali in tricaine. A questo punto, è possibile scattare foto al microscopio a fluorescenza dissezione. Dopo aver fatto, fissare, sezione e immunostain o eseguire ibridazione in situ utilizzando marcatori per il vostro tessuto di interesse.
Figura 1. Progettazione di plexiglass per la fusione dello stampo elastomero usato per fare i piatti tenendo embrione. A x 38 38 mm tondo punte quadrate (~ 5 mm di profondità) è stato indirizzato da un pezzo di plexiglass che è di 50 x 50 mm quadrati e 25 mm di spessore. Circolare, equidistanti pozzi (1,5 mm di diametro) sono stati perforati 1 mm nella plastica. Per fare lo stampo in elastomero per i piatti microiniezione, abbiamo versato elastomero Sylgard in plexiglass e ha permesso di consolidare, come da istruzioni del produttore. Questo stampo elastomero è usato per fare l'iniezione e piastre di isolamento cap.
Figura 2. Cappello animale cernita che precedono il trapianto è importante, come espressione può variare. Tappo animali a sinistra esprime mCherry uniformemente sull'intero tessuto mentre l'espianto di destra è espressione spotty e saranno eliminati.
Figura 3. Un host tadpole ha sviluppato un occhio-come la struttura sul suo fianco da cellule trapiantate cap animali. Un'immagine fluorescente è stato sovrapposto l'immagine campo chiaro.
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Discussion
In questo video, abbiamo dimostrato la nostra versione di tecniche classiche utilizzate dai biologi Xenopus, che noi ruotare per ottenere il tappo test animali trapianto. A temperatura ambiente, embrioni di Xenopus sviluppano molto rapidamente attraverso le fasi 9 e 15. Ponendoli a 14 ° C, lo sviluppo dell'embrione viene rallentato e trapianti di molti altri possono essere eseguite in un esperimento. Se è necessario far crescere gli embrioni a stadi vecchi (> 42/43), poi si consiglia di utilizzare animali transgenici venus YFP, dato che il svanisce proteina fluorescente segnale iniettato nei vecchi girini. Abbiamo usato questo test per stabilire che il tessuto tappo animali che esprimono EFTFs o Noggin è specificato per formare gli occhi come il tessuto. Questo test potrebbe essere usato come un semplice test per stabilire se un gene (s) di interesse è necessario per determinare un destino particolare cellula.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti di ricerca per la Prevenzione della Cecità (Career Development Awards di MEZ e ASV e un finanziamento non vincolante per il Dipartimento di Oftalmologia), la Fondazione E. Matilda Zeigler (MEZ e ASV) e il National Eye Institute / NIH (MEZ , borse di studio e R01EY015748 R01EY017964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
