Tissue Fastställande Använda Transplant Animal Cap (ACT) analys i Xenopus laevis</em
Summary
Animal caps överuttryck genen produkt (er) transplanteras till flanken av att utveckla<em> Xenopus laevis</em> Embryon i syfte att fastställa om vävnaden bestäms.
Abstract
Många proteiner spelar en dubbel roll i embryots utveckling. De som reglerar determination cellen öde i en specifik vävnad kan också påverka utvecklingen av en större region i embryot. Detta gör att definiera sin roll i en viss vävnad svåra att analysera. Till exempel,<em> Kortling</em> Överuttryck i<em> Xenopus laevis</em> Embryon gör att utbyggnaden av hela främre regionen, inklusive ögat<sup> 1,2</sup>. Från detta resultat, är det inte känt om Noggin spelar en direkt roll i ögat beslutet, eller att genom att orsaka en expansion av nervvävnad, Noggin indirekt påverkar ögat bildas. Med denna komplexa fenotyp gör att studera dess öga-specifika roll i cellernas öde beslutsamhet svåra att analysera. Vi har utvecklat en analysmetod som överbryggar detta problem. Med utnyttjande av pluripotenta natur<em> Xenopus laevis</em> Djur CAP<sup> 3</sup> Har vi tagit fram en analys för att testa förmågan hos genen produkt (er), som<em> Kortling</em> Eller ögat fältet transkriptionsfaktorer (EFTFs), att förvandla kapsyler till viss vävnad eller celltyper genom att transplantera denna vävnad på sidan av embryot<sup> 4</sup>. Även om vi har hittat antingen Noggin protein behandling eller en samling av transkriptionsfaktorer kan avgöra näthinnans celler öde i djur mössor, kan detta förfarande användas för att identifiera genen produkt (er) inblandade i att ange andra vävnader också.
Protocol
Discussion
I den här filmen har vi visat vår version av klassiska tekniker som används av Xenopus biologer, som vi arrangeras för att skapa djuret analysen locket transplantation. Vid rumstemperatur Xenopus embryon utvecklas mycket snabbt genom olika stadier 9 och 15. Genom att placera dem vid 14 ° C, utvecklingen av embryot är långsammare och många fler transplantationer kan utföras i ett experiment. Om det är nödvändigt att växa de embryon som äldre stadier (> 42/43), då rekommenderar vi att a…
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från Forskning kring att förebygga blindhet (Career Development Awards MEZ och alkohol samt en obegränsad bidrag till Ögonkliniken), E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ och ASV) och National Eye Institute / NIH (MEZ , bidrag R01EY015748 och R01EY017964).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems/Ambion | AM1340 | ||
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc | 27-30-1 | ||
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instruments, Inc. | P-97 | ||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher | BW17-528Z | ||
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher | NC9644388 | ||
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific | 8609-0160 | ||
| human chorionic gonadotropin | Intervet | 22219 | ||
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | ||
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher | 11-680-21 | ||
| Transfer pipette | Krackeler | 6290-20635A | ||
| Dumostar #5 Forceps | Fisher | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
