Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق doi: 10.3791/1932 Published: May 16, 2010

Summary

يتم زرع الجينات الحيوانية القبعات overexpressing منتج (ق) إلى الجهة تطوير

Abstract

العديد من البروتينات تلعب دورا مزدوجا في التطور الجنيني. يمكن لتلك التي تنظم تقرير مصير الخلية في الأنسجة محددة تؤثر أيضا على تطوير أكبر منطقة جنين. هذا ما يجعل تحديد دورها في نسيج خاص يجعل من الصعب تحليلها. على سبيل المثال ،

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الجزء الأول مجموعة المتابعة للالفحص ACT

  1. توج توليد الحمض النووي الريبي للحقن كما اقترح من قبل الشركة المصنعة ، وذلك باستخدام الفينول منها : طريقة تنقية كلوروفورم (مثل mMessage mMachine كيت ؛ النظم البيولوجية التطبيقية / Ambion ، أوستن ، تكساس). ويستخدم الحمض النووي الريبي الترميز بروتين فلوري باعتبارها المذنبة. نحن تدوين بروتين فلوري إما أصفر (YFP) أو mCherry 5 [كدنا] ، الذي هو في تعبير pCS2 ناقلات +.
  2. سحب أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية لتشكيل الزجاج نصائح مدبب باستخدام مجتذب micropipette. نستخدم سوتر Micropipette بولير ، P - 97 (سوتر الآلات ، وشركة ، نوفاتو ، كاليفورنيا) ، كما هو موضح سابقا 6.
  3. جعل الحلول العقيمة في الجدول رقم 1 من 10 X مارك في لرينغر التعديل (MMR) حل سهم (10 ملي MgCl 2 و 20 ملي بوكل ، و 20 ملي CaCl 2 ؛ HEPES ملي 50 ؛ 1 م كلوريد الصوديوم ؛ تعديلها لدرجة الحموضة 7.5 ، تعقيمها وتخزينها في RT).
  4. عزل الخصيتين من الضفادع الذكور وتخزين الأنسجة عند درجة 4 في محلول معقم من لقاح MMR 1X / جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل سلفات الجنتاميسين ؛ BioWhittaker ، القط # 17 - 518Z). يمكن القيام بذلك حتى قبل أسبوع من بدء التجربة لكنه يفقد فعاليته مع مرور الوقت.
  5. ويمكن إجراء باعتبارها 8X الأسهم ، والتي ؛ : الحل البيض (7.6 درجة الحموضة تعديلها لكلوريد الصوديوم 150 ملم ، 2.62 ملم بوكل ، 0.8 ملي نا 2 هبو 4 و 20 ملي Trizma القاعدة ، 2.62 ملي NaHCO 3 و 4 ملي 2.75 MgSO 1X) يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل الى أسبوعين. ملاحظة : احترس من التلوث في هذا الحل ، لأن هذا سوف يؤثر على نوعية البيض الخاص بك.
  6. إنشاء لوحات الحقن. للقيام بذلك ، ذوبان agarose 1 ٪ في معدل وفيات الأمهات 0.4X في الميكروويف ، إضافة ~ 6 مل حل agarose ذاب في لوحات عيار 60 ملم ، انبسط بلطف an العفن الاستومر (الشكل 1) على رأس من الحل لمنع الفقاعات والسماح لتبرد لحوالي 20 دقيقة في RT. لتحديد العدد المطلوب ، والنظر في عدد من الظروف التجريبية (مثل 1 ، YFP ؛ 2 ، YFP + رأس) ، ويحتاج إلى عدد من الأجنة المضيفة المزروعة. لتجاربنا ، ونحن لا يقل عن 20 توليد اجنة المضيف المزروعة لكل حالة تجريبية. في 18-19 وسوف درجة مئوية ، وتكون الأجنة في هذه المرحلة 15 لمدة ساعة تقريبا. إذا كان يستغرق ساعة واحدة لتنفيذ 20 عملية زرع ، ثم هناك حاجة إلى نقطتين وقت الإخصاب ، على افتراض الأجنة المضيفة قبول جميع عمليات زرع. ولذلك ، ستكون هناك حاجة أطباق الحقن الأربعة (2 × ظروف عملي وقت الإخصاب 2 نقطة = 4). تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
  7. إنشاء لوحات العزل باستخدام غطاء + 1 ٪ agarose 0.7X MMR مع قوالب بالنسبة للوحة الحقن. جعل العدد نفسه من العزلة سقف لوحات الحقن زائد واحد في الوقت الاضافي التسميد نقطة (4 + 2 نقطة التسميد الوقت = 6).
  8. حقن الإناث مع 500 وحدة موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية في وقت متأخر من يوم قبل يوم microinjection. الإناث في مخزن 16-18 درجة مئوية خلال الليل.

الجزء الثاني. RNA Microinjection الأجنة المورق القيطم

ألف التحضير لmicroinjection

  1. إزالة الإناث يسببها هرمونيا ووضعها في خزانات تحتوي على الفرد 1X حل البيض (ELS) ملاحظة : نحن لا نستخدم البيض الذي تم في ELS أكثر من ساعتين كما هو انخفاض جودة البيض. لذلك ، قبل نحو ساعة من التخصيب في المختبر ، ونحن تجاهل كل البيض من خزان بحيث يتم جمع البيض الطازج وضعت فقط.
  2. إعداد الإبرة لmicroinjection بواسطة القص قبالة الطرف للحصول على قطر 25-35 ميكرومتر. وضع الإبرة على لpicoinjector ومعايرتها بحيث يوزع 10 في NL الحقن.
  3. مجموعة حاضنة إلى 14 درجة مئوية.
  4. مرة واحدة وضعت الإناث البيض للإزالة ، على بعد حوالى ساعة من البيض من الدبابة باستخدام ماصة نقل ووضعها في أطباق بتري 60 مم. كما ELS إزالة الكثير من البيض واستبدالها ممكن مع 1X MMR. ويمكن إخصابها البيض على الفور أو البقاء في MMR 1X لمدة تصل إلى ساعة واحدة. لمقايسة زرع ، فمن الأفضل أن يخصب طبقين ، و 80 ٪ كاملة من طبقة واحدة من البيض في مدة تصل إلى ثلاث دفعات منفصلة عند حوالي الساعة 11 صباحا وظهرا ومساء 1. بعد الحقن ، سيتم وضعها في 14 درجة مئوية بحيث أنها ستنمو الى المراحل المطلوبة لعزل غطاء (مرحلة 8،5-9) وزرع (المرحلة 15 ، وانظر الجزء الأول ، # 6 أعلاه).
  5. للتحقق من جودة الخصيتين ، ونحن إجراء التلقيح في الصباح الباكر (~ 08:00) ، والذي يسمح لنا لاستخراج الخصيتين من جهة اخرى ذكر إذا كان من أول الحيوانات المنوية ليست قابلة للحياة. ملاحظة : نحن التجانس ~ 0.25 في الخصيتين MMR 1X 1 مل وإضافة ما يقرب من 5-7 نقاط لكل لوحة من البويضات.
  6. في المختبر تخصيب البويضات مع الخصيتين المتجانس ، وبعد ساعة ، وإزالة الطبقة الهلامية على البيض باستخدام دي هلام الحل (DTT 164μl 1M + 10ML 1M تريس ، ودرجة الحموضة 8.8 إلى 50 مل من الماء nanopure تعقيمها). انتظر حتى تصل إلى عامين لتبدأ مرحلة الخلية والفرز ، والذي يستغرق حوالي 2 ساعة على 18 درجة مئوية أو 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية).
  7. باستخدام transfإيه ماصة ، مصطبغة فرز الأجنة بشكل موحد وتقسيم بالتساوي ، كما هو مبين في الغطاء الحيواني اليسار في الشكل 3 ، في بئر حقن طبق مليء Ficoll + 0.4X MMR 6 ٪.

باء Microinjection

  1. Parafilm تمتد فوق الجزء العلوي من غطاء 60 مم طبق بيتري. ماصة 2 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي الخاص لأول مرة في Parafilm ونضح باستخدام PLI - 100 لملء الخاص إبرة الحقن. تأكد من التحقق من أن الإبرة الاستغناء NL يزال 10 من العينة قبل البدء في الحقن.
  2. حقن الأجنة 20-30 مرحلتين الخلية (سواء blastomeres) مع 500 RNA YFP بيكوغرام في صحن واحد والجين اهتمامكم (على سبيل المثال 20 بيكوغرام رأس RNA) ، بالإضافة إلى RNA YFP في طبق آخر 7.
  3. 100-200 مكان غير حقن الأجنة في نقطة زمنية أخرى في طبق مع حقن محلول Ficoll. نقلها داخل وخارج الحاضنة في نفس الوقت مع حقن الأجنة. هذه هي يستضيف لاستخدامها في الجزء الرابع.
  4. بعد الحقن ، واحتضان جميع الأجنة عند 14 درجة مئوية خلال الليل. أكرر للجميع نقاط الوقت.

الجزء الثالث. عزل قبعات من أجنة الحيوانات حقن

  1. يصل في وقت مبكر من صباح اليوم إلى مرحلة الأجنة. ينبغي أن تكون نقطة أقرب وقت ممكن في مرحلة 9. إزالة تلك التي لم تنج. المضي قدما في الخطوات التالية العمل مع كل نقطة في الوقت دفعات.
  2. تخلصي من حل Ficoll من كل لوحة وإضافة MMR 0.7X الخلفي / حل الجنتاميسين. لسقف صحن العزلة ، إضافة كمية سخية من حل MMR / جنتاميسين 0.7X. طرد الأجنة من آبارهم طبق الحقن باستخدام ماصة نقل ومكان في صحن سقف العزلة الطازجة.
  3. قبعات عزل الحيوانات في حل MMR 0.7X + جنتاميسين ، وحفظ أو 2 أو 3 أجنة سليمة لتنظيمه. ويمكن استخدام إما Gastromaster ، مزودة تلميح عازمة الأصفر إلى 400 ميكرون ، أو زوج من حاد ملقط 5 العدد.
  4. وضع القبعات مرة في 14 درجة مئوية حاضنة حتى اليوم التالي. يجب إزالة الأجنة المضيف من الحاضنة في الوقت نفسه للحفاظ على القبعات في هذه المرحلة التنموية نفس الأنسجة المانحة.

الجزء الرابع. زرع القبعات على الخاصرة

  1. إزالة القبعات والأجنة من نقطة لأول مرة من الحاضنة 14 درجة مئوية ومرحلة الأجنة. الفرز للقبعات موحدة الفلورسنت إيجابية أصفر أو أحمر ، اعتمادا على حقن التتبع (الشكل 2).
  2. حساب عدد من القبعات وإزالة مضاعفة عدد الأجنة لمرحلة 12-13 طبق حقن الطازجة مع MMR 0.7X / حل الجنتاميسين. بالملقط # 5 حادة ، وإزالة الغشاء المحي من كل. نقلها إلى اللوحة مع القبعات ، ولكن كن حذرا. دون أغشية المحية بها ، يمكن فصل الأجنة بسرعة على سطح الماء.
  3. باستخدام gastromaster (نصيحة الصفراء ، والأسلاك 200 250μm عازمة ، أعلى الإعداد) أو # 5 الملقط ، إزالة 200 ميكرومتر مربع على جانب من الأجنة في مرحلة 14-15 (الشكل 3). ثم ، وخفض سقف في نصف (مع gastromaster أو ملقط # 5) ومكان النسيج في الحفرة التي أدلي بها في الجنين المضيف. تدوير الجنين ضد البئر للسماح للشفاء. كما تفعل ذلك لأجنة كثيرة كما يمكنك أثناء وجودهم في المرحلة 15. أكرر للجميع نقاط الوقت.
  4. وسوف تلتئم الجنين عادة في غضون 30 دقيقة. إزالة الخلايا الميتة (أبيض) مع اقتراح لطيف بالفرشاة مع ملقط # 5. بزراعتها في 18 درجة مئوية خلال الليل.
  5. تحت المجهر مضان تشريح والأجنة الفرز مع الأنسجة ، fluorescently المسمى المزروعة. وضعها من جديد في 18 درجة مئوية إلى النمو حتى مرحلة 42-43.
  6. تخدير الحيوانات في tricaine. عند هذه النقطة ، يمكنك التقاط الصور تحت المجهر مضان تشريح. بعد الانتهاء ، الإصلاح ، والقسم immunostain أو تنفيذ في الموقع التهجين باستخدام علامات للأنسجة اهتمامك.

الشكل 1
الشكل 1. تصميم شبكي لصب القالب الاستومر التي تستخدم في صنع أطباق عقد الجنين. A 38 × 38 ملم ذهابا ويحشر مربع (~ 5 ملم العميق) تم توجيهها من قطعة من زجاج شبكي أن 50 × 50 ملم مربع و 25 مم. وقد تم حفر دائرية ، وحفر الآبار متباعدة بشكل متساو (1.5 مم) 1 ملم عمق البلاستيك. لجعل العفن الاستومر للأطباق microinjection ، تدفقت علينا الاستومر Sylgard في زجاج شبكي وسمح لها لترسيخ ، وفقا لتعليمات الصانع. ويستخدم هذا القالب لجعل الاستومر الحقن وألواح العزل الغطاء.

الشكل 2
الشكل 2. قبعة الحيوانية الفرز قبل الزرع هو المهم ، كما يمكن أن يختلف التعبير. قبعة الحيوان على اليسار عن mCherry بالتساوي في جميع أنحاء الأنسجة بينما يزدرع على حق التعبير ومتقطعا ، وسوف يتم التخلص منها.

الشكل 3
الشكل 3. مضيف tadpوقد وضعت أوله بنية تشبه العين على حدودها من زرع الخلايا الحيوانية سقف ، وقد overlayed صورة الفلورسنت على الصورة brightfield.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا الفيديو ، لقد أثبتنا لدينا نسخة من التقنيات التي يستخدمها علماء البيولوجيا الكلاسيكية القيطم ، ونحن ترتيبها لخلق غطاء زرع فحص الحيوانات. في درجة حرارة الغرفة ، والأجنة القيطم تتطور بسرعة كبيرة من خلال المراحل 9 و 15. عن طريق وضعها في 14 درجة مئوية وتباطأ ، ووضع الجنين إلى أسفل ويمكن تنفيذ العديد من عمليات زرع في تجربة واحدة. إذا كان ذلك ضروريا لنمو الأجنة في المراحل القديمة (> 42 / 43) ، ثم نوصي باستخدام حيوانات معدلة وراثيا فينوس YFP ، لأن حقن بروتين فلوري يتلاشى في إشارة القديمة الضفادع الصغيرة. استخدمنا هذا الاختبار لإثبات أن الأنسجة الحيوانية معربا عن سقف EFTFs أو المحدد لتشكيل رأس العين مثل الأنسجة. ويمكن استخدام هذا الاختبار بمثابة اختبار بسيط لتحديد ما إذا كان الجين (ق) من الفائدة ضروري لتحديد مصير خلية معينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من البحوث للوقاية من العمى (جوائز التطوير الوظيفي لMEZ وASV ومنحة غير مقيد إلى قسم العيون) ، ومؤسسة ماتيلدا E. زيغلر (MEZ وASV) والمعهد الوطني للعيون / المعاهد الوطنية للصحة (MEZ والمنح وR01EY015748 R01EY017964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).
تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص<em> القيطم المورق</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter