Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной Xenopus laevis Published: May 16, 2010 doi: 10.3791/1932
Automatic Translation
1, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University

Summary

Животное шапки гиперэкспрессией гена продукт (ы) пересаживают на фланге развивающихся

Abstract

Многие белки играют двойную роль в эмбриональном развитии. Те, которые регулируют определение ячейки судьбу в конкретной ткани также может влиять на развитие большей области эмбриона. Это делает определение ее роли в определенной ткани трудно анализировать. Например,

Protocol

Часть I. Настройка для ACT Пробирной

  1. Создание ограничен РНК для инъекций в соответствии с предложением производителя, используя свои фенол: хлороформ метод очистки (например, mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Амбион, Остин, Техас). РНК кодирования флуоресцентный белок используется в качестве индикатора. Мы транскрибировать либо желтый флуоресцентный белок (YFP) или mCherry 5 кДНК, которая находится в вектор экспрессии pCS2 +.
  2. Вытяните боросиликатного стекла капилляров с образованием конической советы стекла, используя съемник микропипетки. Мы используем Саттер микропипетки Puller, Р-97 (Саттер Instruments, Inc, Новато, Калифорния), как описано выше 6.
  3. Сделать стерильных растворов в таблице 1 от 10 X Марка изменения Рингера (MMR) маточного раствора (10 мМ MgCl 2, 20 мМ KCl, 20 мМ CaCl 2, 50 HEPES мМ, 1 М NaCl, доводили до рН 7,5, автоклавировать и хранить при RT).
  4. Изолировать яички от мужчин лягушку и хранить ткани при температуре 4 ° С в стерильный раствор 1X MMR / гентамицин (50 мкг / мл гентамицина сульфата; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Это может быть сделано в течение недели до начала эксперимента, но она теряет свою эффективность с течением времени.
  5. Яйцо укладки раствор (1X: 150 мМ NaCl, 2,62 мМ KCl, 0,8 мМ Na 2 HPO 4, 20 мМ Trizma базы, 2,62 мМ NaHCO 3 и 2,75 мМ MgSO 4, доводили до рН 7,6) могут быть сделаны как 8X акции, которые можно хранить при температуре 4 ° С до двух недель. Примечание: следите за загрязнение в этом решении, так как это повлияет на качество вашего яйца.
  6. Создание инъекции пластин. Для этого растопите 1% агарозном в 0.4X MMR в микроволновой печи, добавьте ~ 6 мл расплавленного решение агарозы на 60 мм пластинами, слегка раскатать эластомера форму (рис. 1) в верхней части решение, чтобы избежать пузырей и дайте остыть в течение приблизительно 20 минут при комнатной температуре. Для определения количества необходимости, рассмотреть ряд экспериментальных условиях (например, 1, YFP, 2, YFP + Ноггин) и количество пересаженных эмбрионов хост необходимо. Для наших экспериментов, мы создаем не менее 20 пересаженных эмбрионов хост для каждой экспериментальной состоянии. На 18-19 ° C, эмбрионы будут на стадии 15 около часа. Если это занимает один час для проведения 20 трансплантаций, то две точки оплодотворения время необходимы, предполагая, что хозяин эмбрионов принять все трансплантатов. Таким образом, четыре блюда инъекции будут необходимы (2 ехр условия х 2 очка оплодотворения время = 4). Храните пластины при температуре 4 ° С не более одной недели.
  7. Создание колпачок изоляции пластин с использованием 1% агарозном + 0,7 MMR с формы, как и для инъекций пластины. Сделать столько же крышка изоляции как закачка пластин плюс одна посторонняя за каждое очко время оплодотворения (4 + 2 точках оплодотворения время = 6).
  8. Inject самок с 500 единиц человеческого хорионического гонадотропина в конце дня на день, предшествующий микроинъекции. Магазин женщин при температуре 16-18 ° С в течение ночи.

Часть II. РНК микроинъекции Xenopus laevis эмбрионов

А. Подготовка к микроинъекции

  1. Удалить гормонально индуцированной женщин и разместить их в отдельных резервуарах, содержащих 1X откладки яиц решение (ELS). Примечание: мы не используем яйца, которые были в ELS более двух часов, как и качество яиц снижается. Таким образом, примерно за час до оплодотворения в пробирке, отбросить все яйца из бака, так что только свежие яйца собираются.
  2. Подготовка игла для микроинъекции по Ножницы с наконечником для получения 25-35 мкм в диаметре. Место иглу на picoinjector и калибровки так, чтобы она распределяет 10 NL на инъекцию.
  3. Установить инкубаторе до 14 ° C.
  4. Как только самки откладывали яйца в течение часа, удалить яйца из бака использованием передачи пипетки и их размещение в 60 мм чашки Петри. Удалить столько ELS из яиц, как можно и заменить 1X MMR. Яйца могут быть оплодотворены сразу или остаться в 1X MMR до часа. Для пересадки анализа, то лучше, чтобы оплодотворить два блюда, 80% из одного слоя яйца в до трех отдельных партий на уровне около 11 утра, в полдень и 1 час. После инъекции, они будут размещены в 14 ° С, так что они будут расти до желаемого этапы колпачок изоляции (стадия 8,5-9) и трансплантацией (стадия 15; см. Часть I, # 6 выше).
  5. Для проверки качества яичек, мы выполняем рано утром оплодотворения (~ 8 утра), что позволяет нам извлечь яички от другого самца, если сперматозоиды от первого не является жизнеспособным. Примечание: мы гомогенизации ~ 0,25 яички в 1 мл 1X MMR и добавить примерно от 5 до 7 капель на чашку ооцитов.
  6. В пробирке оплодотворить яйца с гомогенизированный яичек и, час спустя, удалить слой желе на яйца использованием де-желе решение (164μl 1M DTT + 10 мл 1М Трис, рН 8,8 до 50 мл воды автоклавного NanoPure). Подождите, пока они не достигают двух-клеточной стадии, чтобы начать сортировку, которая занимает около 2 часов при 18 ° С или 1,5 часа при комнатной температуре (22 ° С).
  7. Использование Transfэ пипетки, сортировать равномерно пигментированные и равномерно деления эмбрионов, как показано в левой крышки животных на рисунке 3, в колодец инъекции блюдо заполнено 0.4X MMR + 6% Ficoll.

Б. Микроинъекция

  1. Стретч парафильмом поверх 60 мм крышкой чашки Петри. Внесите 2 мкл ваш первый образец РНК на парафильмом и аспирации использованием PLI-100, чтобы заполнить Ваш инъекционной иглой. Не забудьте проверить, что игла находится еще дозирования 10 NL образца до начала инъекции.
  2. Inject 20-30 двух-клеточной стадии эмбрионов (оба бластомеров) с 500 пг YFP РНК в одном блюде и ваш интерес гена (например, 20 пг Ноггин РНК), а также YFP ​​РНК в другом блюде 7.
  3. Место 100-200 неинъекционные эмбрионы в момент времени, в другом инъекции блюдо с решением Ficoll. Переместите их в и из инкубатора в то же время, как вводить эмбрионы. Эти узлы, которые будут использоваться в Части IV.
  4. После инъекции, инкубировать всех эмбрионов при 14 ° С в течение ночи. Повторите эти действия для всех временных точках.

Часть III. Изолировать животных шапки из вводят эмбрионы

  1. Прибытие рано утром на стадии эмбрионов. Раннее время точка должна быть на стадии 9. Удалите те, которые не сохранились. Продолжайте следующие шаги работы с каждый момент времени в пакетном режиме.
  2. Вылейте Ficoll решение от каждой пластины и добавить обратно 0,7 MMR / гентамицин решение. Чтобы блюдо изоляции крышкой, добавьте большом количестве 0,7 MMR / гентамицин решение. Выбить эмбрионы от их инъекции блюдо скважин с помощью пипетки передачи и место в только что приготовленное блюдо изоляции шапку.
  3. Изолируйте животное шапки в 0,7 MMR раствор + гентамицин, сохраняя 2 или 3 неизменными эмбрионов для постановки. Либо Gastromaster, оснащенный желтый наконечник согнуты до 400 мкм, или пару острых № 5 щипцы могут быть использованы.
  4. Положите шапки еще в 14 ° C инкубаторе до следующего дня. Хост эмбрионы должны быть удалены из инкубатора в то же время, как шапки, чтобы держать их на том же этапе развития в качестве донора ткани.

Часть IV. Трансплантация колпачки на фланге

  1. Удалить колпачки и эмбрионы от первой точки времени от 14 ° C инкубатора и стадии эмбрионов. Сортировать для равномерного желтого или красного флуоресцентного-положительных шапки, в зависимости от трассирующих вводят внутривенно (рис. 2).
  2. Подсчитайте количество крышек и удалить удвоить число этап 12-13 эмбрионов свежеприготовленный инъекции блюдо с 0,7 MMR / гентамицин решение. С резким щипцов # 5, удалить желточной мембраны от каждого. Передача их в тарелку с шапки, но будьте осторожны. Без их мембран желточной, эмбрионы могут быстро диссоциируют на поверхности воды.
  3. Использование gastromaster (желтый наконечник, 200-250 мкм согнуты проволока, высокие настройки) или # 5 щипцы, удалить 200 мкм квадрат на стороне эмбриона на стадии 14-15 (рис. 3). Затем, разрезать пополам крышкой (с gastromaster или # 5 щипцы) и поместите ткань в отверстие, сделанное в принимающей эмбриона. Поворот эмбриона против хорошо, чтобы исцеление. Делайте это в течение как многие эмбрионы, как вы можете, пока они находятся на стадии 15. Повторите эти действия для всех временных точках.
  4. Эмбрион, как правило, заживают в течение 30 минут. Удаление отмерших клеток (белые) с нежным чистки движения с # 5 щипцами. Вырастить их при 18 ° С в течение ночи.
  5. Под рассекает флуоресцентного микроскопа, сортировать эмбрионов с флуоресцентно меченных, пересаженные ткани. Положите их обратно при 18 ° С расти до стадии 42-43.
  6. Анестезию животных в tricaine. На данный момент, можно делать снимки под флуоресцентным микроскопом вскрытии. После того как вы сделали, исправить, раздел и immunostain или выполнить на месте гибридизации с использованием маркеров для ваших тканей, представляющих интерес.

Рисунок 1
Рисунок 1. Дизайн оргстекла для литья эластомеров форма используется для изготовления блюд эмбриона холдинга. 38 х 38 мм круглый угол квадрата (~ 5 мм в глубину) был направлен из кусок оргстекла, что составляет 50 х 50 квадратных мм и толщиной 25 мм. Циркуляр, равномерно расположенных скважин (1,5 мм в диаметре) было пробурено 1 мм вглубь пластика. Для того, чтобы эластомера формы для микроинъекции посуду, заливают мы Sylgard эластомера в оргстекла и позволило ему укрепить, в соответствии с инструкциями производителя. Этот эластомер формы используется, чтобы сделать инъекцию и пластины крышки изоляции.

Рисунок 2
Рисунок 2. Животное шапка сортировки до трансплантации важно, так как выражение может меняться. Животное крышки на левом выражает mCherry равномерно по всей ткани в то время как эксплантов на право имеет пятнистый выражения и будет отброшен.

Рисунок 3
Рисунок 3. Хост tadpоле разработала глаз-подобную структуру на своем фланге от пересаженных клеток шапка животного. флуоресцентное изображение было наложенных на изображение светлого.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом видео, мы продемонстрировали нашу версию классических методов, используемых биологами Xenopus, которые мы переставить создать трансплантации животным шапка анализа. При комнатной температуре эмбрионы Xenopus развиваются очень быстро через этапы 9 и 15. Разместив их на 14 ° C, развитие зародыша замедляется и многие другие трансплантации могут быть выполнены в одном эксперименте. Если необходимо расти эмбрионов старших возрастах (> 42/43), то мы рекомендуем использовать трансгенных Венера YFP животных, так как вводят флуоресцентный белок сигнал затухает в старых головастиков. Мы использовали этот анализ, чтобы установить, что ткани животного шапка выражения EFTFs или Ноггин указан в форме глаз, как ткань. Этот анализ может быть использован как простой тест, чтобы установить, является ли ген (ы), представляющих интерес, необходимую для определения частности судьбу клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантами от исследований в области профилактики слепоты (по развитию карьеры награждения МЭЗ и АСВ и неограниченный предоставляют отделения офтальмологии), Е. Матильда Зиглер Foundation (МЭЗ и АСВ) и Национального Института глаза / NIH (МЭЗ , гранты R01EY015748 и R01EY017964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).

Tags

Биология развития выпуск 39 лягушки трансплантация животных шапки эксплантов эктодермы Xenopus laevis башка сотовые судьбы определение
Ткань Определение Использование трансплантации животных Cap (ACT) в Пробирной<em> Xenopus laevis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue… More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter