Summary
Animales que sobreexpresan genes tapas de producto (s), se trasplanta al costado de desarrollo
Abstract
Muchas proteínas juegan un doble papel en el desarrollo embrionario. Las que regulan la determinación de destino celular en un tejido específico también puede afectar el desarrollo de una región más grande del embrión. Esto hace que la definición de su papel en un determinado tejido difícil de analizar. Por ejemplo,
Protocol
Parte I. La configuración para el ensayo ACT
- Generar ARN tope para la inyección según lo sugerido por el fabricante, utilizando sus fenol: cloroformo método de purificación (por ejemplo, mMessage mMachine Kit, Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). ARN que codifica una proteína fluorescente se utiliza como trazador. Transcribimos cualquier proteína amarilla fluorescente (YFP) o mCherry 5 cDNA, que se encuentra en un vector de expresión pCS2 +.
- Tire de los tubos de vidrio borosilicato capilares para formar puntas cónicas de vidrio utilizando un extractor de micropipeta. Usamos Sutter Micropipeta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), como se describió anteriormente 6.
- Que las soluciones estériles en la Tabla 1 de un 10 X de Marc de modificación del timbre (MMR) solución madre (10 mM de MgCl2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, HEPES 50 mM, NaCl 1 M, ajustada a pH 7,5, autoclave y se almacena a RT).
- Aislar a los testículos de una rana macho y almacenar el tejido a 4 ° C en una solución estéril de 1X MMR / gentamicina (50 mg / ml de sulfato de gentamicina; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Esto se puede hacer hasta una semana antes del inicio del experimento, pero es pierde su eficacia con el tiempo.
- Solución de la puesta de huevos (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO3 y 2,75 mM MgSO 4, se ajusta a pH 7,6) se puede hacer como una acción de 8x, que se puede almacenar a 4 ° C durante hasta dos semanas. Nota: ten cuidado con la contaminación en esta solución, ya que esto afectará la calidad de sus óvulos.
- Generar las placas de la inyección. Para ello, se funden agarosa al 1% en 0,4 x MMR en un horno de microondas, añadir ~ 6 mL de solución agarosa derretida en 60 placas mm, suavemente desenrollar un molde de elastómero (Figura 1) en la parte superior de la solución para evitar las burbujas y dejar enfriar por unos 20 minutos a temperatura ambiente. Para determinar el número necesario, considerar el número de condiciones experimentales (por ejemplo 1, YFP, 2, YFP Noggin +) y es necesario el número de embriones transplantados de host. Para nuestros experimentos, generar por lo menos 20 embriones transplantados de host para cada condición experimental. A 18-19 ° C, los embriones serán en la etapa 15 por una hora. Si se toma una hora para llevar a cabo 20 trasplantes, a continuación, dos momentos de fertilización se necesitan, asumiendo que los embriones de acogida aceptará todos los trasplantes. Por lo tanto, cuatro platos de inyección será necesaria (2 x 2 exp condiciones de los puntos de tiempo fertilización = 4). Almacenar las placas a 4 ° C durante un máximo de una semana.
- Generar las placas de aislamiento con tapa de agarosa al 1% + 0.7X MMR con los moldes en cuanto a la placa de la inyección. Hacer el mismo número de aislamiento de la PAC como placas inyección y un punto extra por el tiempo de fertilización (4 + 2 puntos de tiempo fertilización = 6).
- Inyectar las hembras con 500 unidades de gonadotropina coriónica humana al final del día el día antes de la microinyección. Mujeres almacenar a 16-18 ° C durante la noche.
Parte II. ARN Microinyección de embriones de Xenopus laevis
A. Preparación para la microinyección
- Quitar las mujeres hormonalmente inducida y colocarlos en jaulas individuales que contiene 1X solución de puesta de huevos (ELS). Nota: no usamos los huevos que han estado en el ELS más de dos horas como la calidad de los huevos se reduce. Por lo tanto, una hora antes de la fecundación in vitro, se descartan todos los huevos en el tanque de modo que los huevos recién puestos sólo se recogen.
- Prepare la aguja para la microinyección cortando la punta para obtener un diámetro de 25-35 micras. Coloque la aguja en la picoinjector y calibrar de modo que se prescinde de 10 nl por inyección.
- Establecer una incubadora a 14 ° C.
- Una vez que las hembras han puesto huevos durante aproximadamente una hora, retirar los óvulos del tanque utilizando una pipeta de transferencia y los situará en 60 mm placas de Petri. Eliminar la mayor cantidad de ELS de los huevos como sea posible y vuelva a colocar con 1X MMR. Los huevos pueden ser fertilizados inmediatamente o permanecer en el MMR 1X para un máximo de una hora. Para el ensayo de trasplante, lo mejor es fertilizar dos platos, el 80% de su capacidad de una sola capa de huevos en un máximo de tres lotes separados alrededor de las 11 am, al mediodía y la 1 pm. Después de la inyección, que será colocado a 14 ° C para que puedan llegar a las etapas que desee para el aislamiento de la tapa (etapa 8,5-9) y el trasplante (la etapa 15, véase la Parte I, # 6).
- Para comprobar la calidad de los testículos, se realiza una fertilización mañana temprano (~ 8 am), lo que nos permite extraer los testículos de otro hombre, si el esperma de la primera no es viable. Nota: ~ 0,25 homogeneizar los testículos en una MMR mL 1X y añadir aproximadamente 5 a 7 gotas por la placa de los ovocitos.
- In vitro fertilizar los huevos con testículos homogeneizada y, una hora más tarde, eliminar la capa gelatinosa de los huevos con jalea de solución (164μl 1M TDT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 hasta 50 ml de agua Nanopure autoclave). Espere hasta que llegan a la etapa de dos células para comenzar la clasificación, que dura aproximadamente 2 horas a 18 ° C o 1,5 horas a temperatura ambiente (22 ° C).
- El uso de un transfer pipeta, embriones tipo uniformemente pigmentados y dividiendo por igual, como se muestra en la tapa de los animales a la izquierda en la figura 3, en el pozo de inyección de un plato lleno de 0,4 x Ficoll MMR + 6%.
B. microinyección
- Parafilm tramo en la parte superior de una tapa de plato de Petri de 60 mm. Pipetear 2 l de la primera muestra de ARN en el Parafilm y se aspira con el PLI-100 para cubrir la aguja de la inyección. Asegúrese de verificar que la aguja está todavía dispensación 10 nl de la muestra antes de comenzar la inyección.
- 20-30 inyectar dos células de embriones etapa (dos blastómeros) con 500 pg de ARN YFP en un plato y el gen de interés (por ejemplo, 20 pg Noggin ARN), además de ARN YFP en otro plato 7.
- 100-200 lugar no inyecta embriones por cada punto de tiempo en el otro plato de la inyección con la solución de Ficoll. Moverlos dentro y fuera de la incubadora a la vez que los embriones inyectados. Estos son los anfitriones que se utilizan en la Parte IV.
- Después de la inyección, todos los embriones se incuban a 14 ° C durante la noche. Repita este procedimiento para todos los tiempos.
Parte III. Aislar a las tapas de los animales a partir de embriones inyectados
- Llegue temprano en la mañana a la etapa de los embriones. El menor período de tiempo debe estar en la etapa 9. Eliminar aquellos que no sobrevivieron. Continúe con los pasos siguientes de trabajo con cada punto del tiempo en lotes.
- Retirar la solución de Ficoll de cada plato y añadir de nuevo MMR 0.7X / solución de gentamicina. A un plato de aislamiento de tapa, añadir una cantidad generosa de 0.7X MMR / gentamicina solución. Desalojar a los embriones de los pozos de inyección de plato con una pipeta de transferencia y el lugar en el plato de tapa de aislamiento recién preparada.
- Aislar a las tapas de los animales en 0.7X MMR + solución de gentamicina, mantener 2 ó 3 embriones intactos para la estadificación. O bien el Gastromaster, equipado con una punta amarilla doblada a 400 micras, o un par de pinzas afiladas número 5 se puede utilizar.
- Ponga las tapas en 14 ° C incubadora hasta el día siguiente. Los embriones de acogida deben ser retirados de la incubadora, al mismo tiempo como las tapas para evitar que en la misma etapa de desarrollo como el tejido de un donante.
Parte IV. El trasplante de tapas en el flanco
- Quite las tapas y los embriones desde el punto de primera vez de los 14 ° C incubadora y la etapa de los embriones. Clasificar para el uniforme de color amarillo o rojo fluorescente-positivas las tapas, en función de la inyección del trazador (Figura 2).
- Cuente el número de tapas y eliminar el doble del número de la etapa 12-13 embriones a un plato de inyección recién preparada con 0.7X MMR / solución de gentamicina. Con unas pinzas afiladas # 5, quitar la membrana vitelina de cada uno. Transferirlos a la plancha con los tapones, pero tenga cuidado. Sin su membrana vitelina, los embriones se puede disociar rápidamente en la superficie del agua.
- Utilizando el gastromaster (punta amarilla, 200 250 micras alambre doblado, valor más alto) o # 5 pinzas, quite una de 200 micras cuadradas en la parte del embrión en la etapa 14-15 (Figura 3). Luego, cortar una tapa en la mitad (con la gastromaster o las pinzas # 5) y colocar el tejido en el agujero hecho en el embrión de acogida. Gire el embrión contra el bien para permitir la cicatrización. Haga esto para los embriones que puedas mientras están en la etapa 15. Repita este procedimiento para todos los tiempos.
- El embrión usualmente sanan en un lapso de 30 minutos. Eliminar las células muertas (blancas) con un movimiento de cepillado suave con un fórceps # 5. Ellos crecen a 18 ° C durante la noche.
- Bajo la lupa de fluorescencia, los embriones de tipo fluorescente con la etiqueta, el tejido trasplantado. Ponerlos de nuevo a 18 ° C para crecer hasta la etapa 42-43.
- Anestesiar a los animales en tricaína. En este punto, usted puede tomar fotos debajo de un microscopio de fluorescencia de disección. Una vez haya terminado, fijar, sección y inmunotinción o llevar a cabo la hibridación in situ utilizando marcadores para tejido de interés.
Figura 1. Diseño de plexiglás para la fundición del molde elastómero utilizado para la fabricación de platos embrión explotación. A 38 x 38 mm con las esquinas redondeadas cuadrados (~ 5 mm de profundidad), ha sido derrotado por un pedazo de plexiglás que es de 50 x 50 mm de lado y 25 mm de espesor. Circular, los pozos espaciados uniformemente (1,5 mm de diámetro) se han perforado 1 mm de profundidad en el plástico. Para hacer el molde de elastómero para los platos de microinyección, se vierte elastómero Sylgard en el plexiglás y permite que se solidifique, según las instrucciones del fabricante. Este molde elastómero se utiliza para hacer la inyección y las placas de tapa de aislamiento.
Figura 2. Tapa de la clasificación de los animales antes del trasplante es importante, ya que la expresión puede variar. Tapa de animales de la izquierda expresa mCherry uniformemente a través de los tejidos, mientras que el explante de la derecha tiene la expresión irregular y no se tiene.
Figura 3. A tadp anfitriónole ha desarrollado una estructura con forma de ojo en su flanco de trasplantes de células de animales de la PAC. Una imagen fluorescente se ha superpuesto en la imagen de campo claro.
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Discussion
En este video, hemos demostrado nuestra versión de las técnicas clásicas utilizadas por los biólogos de Xenopus, que reorganizan para crear la tapa de los animales del ensayo de transplante. A temperatura ambiente, los embriones de Xenopus se desarrollan muy rápidamente a través de las etapas 9 y 15. Poniéndolos a 14 ° C, el desarrollo del embrión es más lento y muchos más trasplantes se pueden realizar en un experimento. Si es necesario hacer crecer los embriones a los mayores niveles (> 42/43), entonces le recomendamos que utilice transgénicos venus animales YFP, ya que la inyectada desaparece la señal de la proteína fluorescente en los mayores los renacuajos. Se utilizó esta prueba para establecer que el tejido de los animales que expresan EFTFs tapa o Noggin se especifica para formar los ojos, como el tejido. Este ensayo podría ser utilizado como una prueba sencilla para determinar si un gen (s) de interés es necesario para determinar un destino de la célula en particular.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de Investigación para Prevención de la Ceguera (Premios de Desarrollo Profesional para MEZ y ASV y una beca para el Departamento de Oftalmología), la Fundación E. Matilda Ziegler (MEZ y ASV) y el National Eye Institute / NIH (MEZ , las subvenciones y R01EY015748 R01EY017964).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Applied Biosystems | AM1340 | |
| Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) | FHC, Inc. | 27-30-1 | |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | BW17-528Z | |
| Sylgard/elastomer Kit 1.1lb | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | |
| human chorionic gonadotropin | Intervet Inc. | 22219 | |
| Pico-Injector Microinjection Systems | Harvard Apparatus | 650003 | |
| Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator | Fisher Scientific | 11-680-21 | |
| Transfer pipette | Krackeler Scientific, Inc. | 6290-20635A | |
| Dumostar #5 Forceps | Fisher Scientific | 11295-10 |
References
- Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
- Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
- Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. , (2008).
- Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. , (2009).
