Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Tissue Fastställande Använda Transplant Animal Cap (ACT) analys i Xenopus laevis doi: 10.3791/1932 Published: May 16, 2010

Summary

Animal caps överuttryck genen produkt (er) transplanteras till flanken av att utveckla

Abstract

Många proteiner spelar en dubbel roll i embryots utveckling. De som reglerar determination cellen öde i en specifik vävnad kan också påverka utvecklingen av en större region i embryot. Detta gör att definiera sin roll i en viss vävnad svåra att analysera. Till exempel,

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Del I. Set-up för ACT-analys

  1. Generera utjämnade RNA för injektion som föreslås av tillverkaren, som använder sin fenol: kloroform reningsmetod (t.ex. mMessage mMachine Kit, Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA kodar ett fluorescerande protein används som spårgas. Vi transkribera antingen gula fluorescerande protein (YFP) eller mCherry 5 cDNA, som är i en pCS2 + uttryck vektor.
  2. Dra borosilikatglas kapillärrör att bilda koniska glas tips med hjälp av en mikropipett avdragare. Vi använder Sutter Mikropipett avdragare, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), som tidigare beskrivits 6.
  3. Gör sterila lösningar i tabell 1 från en 10 X Marc ändrade Ringers (MMR)-lösning lager (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 mM HEPES, 1 M NaCl, justerad till pH 7,5, autoklaveras och förvaras vid RT).
  4. Isolera testiklar från en manlig groda och lagra vävnaden vid 4 ° C i en steril lösning av 1X MMR / gentamicin (50 mikrogram / ml gentamicin sulfat, BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Detta kan göras upp till en vecka före starten av försöket, men det är förlorar sin effekt med tiden.
  5. Äggläggningen lösning (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mm Trizma bas, 2,62 mM NaHCO 3 och 2,75 mM MgSO 4, som justerats till pH 7,6) kan göras som en 8X lager, vilket kan förvaras vid 4 ° C i upp till två veckor. OBS: se upp för föroreningar i denna lösning, eftersom detta kommer att påverka kvaliteten på dina ägg.
  6. Generera injektion plattor. För att göra detta, smälta 1% agaros i 0.4X MMR i en mikrovågsugn, lägg till ~ 6 ml smält agaroslösningen i 60 mm plattor, försiktigt rulla en elastomer mögel (figur 1) på toppen av lösning för att förhindra bubblor och låt svalna ca 20 minuter vid RT. För att bestämma det antal som behövs, anser att antalet experimentella förhållanden (t.ex. 1, YFP, 2, YFP + Noggin) och antalet transplanterade värd embryon behövs. För våra experiment skapar vi minst 20 transplanterade värd embryon för varje experimentell skick. Vid 18-19 ° C, embryon kommer att vara i stadium 15 i ungefär en timme. Om det tar en timme att utföra 20 transplantationer, sedan två gödsling tidpunkter behövs, förutsatt värd embryon acceptera alla transplantationer. Därför kommer fyra injektion rätter behövas (2 exp villkor x 2 befruktning tidpunkter = 4). Förvara plattorna vid 4 ° C i upp till en vecka.
  7. Generera plattor CAP isolering med 1% agaros + 0,7 x MMR med formar som för injektion plattan. Gör samma antal mössa isolering som injektion plattor plus en extra per befruktning tidpunkt (4 + 2 befruktning tidpunkter = 6).
  8. Injicera honor med 500 enheter humant koriongonadotropin sent dagen före mikroinjektion. Förvara honor vid 16-18 ° C över natten.

Del II. RNA mikroinjektion av Xenopus laevis embryon

A. Förberedelser för mikroinjektion

  1. Ta bort hormonellt inducerade kvinnliga och placera dem i enskilda behållare som innehåller 1X äggläggningen lösning (ELS). OBS: vi använder inte ägg som har varit i ELS mer än två timmar som äggens kvalitet minskar. Därför cirka en timme före provrörsbefruktning, kasta vi alla ägg i tanken så att endast nylagda äggen samlas in.
  2. Förbered nålen för mikroinjektion av snipping bort spetsen för att få en 25-35 ìm diameter. Placera nålen på picoinjector och kalibrera den så att den avstår 10 Nl per injektion.
  3. Ställ en inkubator till 14 ° C.
  4. När honorna har lagt ägg i ungefär en timme, ta bort ägg från tanken med hjälp av en pipett och placera dem i 60 mm petriskålar. Ta bort så mycket ELS från ägg som möjligt och ersätta med 1X MMR. Äggen kan befruktas direkt eller bo i 1X MMR upp till en timme. För transplantation analysen, är det bäst att befrukta två rätter, 80% full av ett enda lager av ägg i upp till tre separata partier runt klockan 11 middagstid och 1 pm. Efter injektionen kommer de att placeras vid 14 ° C så att de kommer att växa till den önskade steg för cap isolering (steg från 8,5 till 9) och transplantation (stadium 15, se del I, # 6 ovan).
  5. För att kontrollera kvaliteten på testiklarna, utför vi en tidig morgon fertilisering (~ 8 AM), vilket ger oss möjlighet att utvinna testiklarna från en annan hane om spermier från det första inte är genomförbar. Observera: Vi homogenisera ~ 0,25 testiklar i 1 ml 1X MPR och lägg ca 5 till 7 droppar per fat oocyter.
  6. In vitro befrukta äggen med homogeniserade testiklar, och en timme senare, ta bort gelé pälsen på äggen med hjälp av de-gelé lösning (164μl 1M DTT + 10mL 1M Tris, pH 8,8 upp till 50 ml autoklaveras nanopure vatten). Vänta tills de når två-cell steg att börja sortera, som tar ca 2 timmar vid 18 ° C eller 1,5 timmar i rumstemperatur (22 ° C).
  7. Använda en ÖverfER pipett, sortera jämnt pigmenterade och jämnt dela embryon, som visas i den vänstra djuret locket i figur 3 i brunnen av en injektion skål fylld med 0.4X MMR + 6% Ficoll.

B. mikroinjektion

  1. Sträck Parafilm över toppen av en 60 mm petriskål lock. Pipettera 2 ìl av din första RNA-prov på Parafilm och aspirera med PLI-100 att fylla din injektionsnål. Var noga med att kontrollera att nålen fortfarande är dispensering 10 nL prov innan injektion.
  2. Injicera 20-30 två-cells steg embryon (båda blastomerer) med 500 pg YFP RNA i en skål och dina gener av intresse (t.ex. 20 pg Noggin RNA) plus YFP RNA i en annan skål 7.
  3. Placera 100-200 icke injicerade embryon per tidpunkt i en annan injektion maträtt med Ficoll lösningen. Flytta dem in och ut ur kuvösen samtidigt som den injicerade embryona. Dessa är de värdar som ska användas i del IV.
  4. Efter injektion, inkubera alla embryon vid 14 ° C över natten. Upprepa för alla tidpunkter.

Del III. Isolera djuret kapsyler från injiceras embryon

  1. Kommer tidigt på morgonen för att scenen embryona. Den tidigaste tidpunkt bör vara stadium 9. Ta bort de som inte överlevde. Fortsätt med följande steg att arbeta med varje tidpunkt i omgångar.
  2. Häll av Ficoll lösningen från varje tallrik och lägg tillbaka 0,7 x MMR / gentamicin lösning. För att en mössa isolering fat, lägg en generös mängd av 0,7 x MMR / gentamicin lösning. Få bort embryon från sina brunnar injektion maträtt med hjälp av en pipett och plats i nyberedda locket isolering maträtt.
  3. Isolera djuret lock i 0,7 x MMR + gentamicin lösning, att hålla 2 eller 3 intakt embryon för iscensättning. Antingen Gastromaster, försedd med en gul spets böjd till 400 ìm, eller ett par vassa nummer 5 pincett kan användas.
  4. Sätt lock bakåt i 14 ° C inkubator till nästa dag. Värden embryon bör tas bort från inkubatorn samtidigt som lock för att hålla dem på samma utvecklingsstadium som givaren vävnad.

Del IV. Transplantation av Caps på flanken

  1. Ta bort kapsyler och embryon från den första tidpunkten från 14 ° C inkubator och scen embryona. Sortera för enhetlig gul eller röd fluorescerande-positiv mössor, beroende på spårämne injiceras (Figur 2).
  2. Räkna antalet kapsyler och ta bort dubbla antalet steg 12-13 embryon till en nygjord injektion skålen med 0,7 x MMR / gentamicin lösning. Med skarp # 5 tång, ta bort vitelline membranet från varje. Överföra dem till plåten med lock, men var försiktig. Utan deras vitelline membran, kan embryon skilja snabbt på vattenytan.
  3. Använda gastromaster (gul spets, 200-250μm böjd tråd högsta inställningen) eller # 5 tång, ta bort en 200 ìm kvadrat på sidan av embryot i stadium 14-15 (Figur 3). Sedan skär en keps i halv (med gastromaster eller # 5 pincett) och placera vävnaden i hålet som gjorts i den mottagande embryot. Rotera embryot mot brunnen för att möjliggöra läkning. Gör detta för så många embryon som du kan medan de är på scen 15. Upprepa för alla tidpunkter.
  4. Embryot vanligtvis läker inom 30 minuter. Ta bort döda celler (vit) med en mjuk borsta rörelse med en # 5 pincett. Odla dem vid 18 ° C över natten.
  5. Enligt dissekera fluorescensmikroskop, sortera embryon med fluorescerande-märkta, transplanterade vävnaden. Sätt dem vid 18 ° C för att växa fram steg 42-43.
  6. Bedöva djur i tricaine. I det här läget kan du ta bilder under en fluorescens dissekera mikroskop. När du är klar, fixa, sektion och immunostain eller utföra in situ hybridisering med hjälp av markörer för din vävnad av intresse.

Figur 1
Figur 1. Design av plexiglas för gjutning av elastomer mögel används för att göra maträtter embryo innehav. En 38 x 38 mm runda hörn kvadrat (~ 5 mm djup) har dragna ur en bit plexiglas som är 50 x 50 mm i kvadrat och 25 mm tjock. Cirkulär, jämnt fördelade brunnar (1,5 mm diameter) har borrats 1 mm djupt in i plasten. För att göra elastomer mögel för mikroinjektion rätter, hällde vi Sylgard elastomer i plexiglas och lät det stelna, enligt tillverkarens anvisningar. Detta elastomer mögel används för att göra injektionen och mössa tallrikar isolering.

Figur 2
Figur 2. Animal cap sortering före transplantationen är viktigt, eftersom uttrycket kan variera. Animal locket på vänster uttrycker mCherry jämnt vävnaden medan Explantation till höger har ojämna uttryck och kommer att slängas.

Figur 3
Figur 3. En mängd tadpOle har utvecklat ett öga-liknande struktur på sin flank från transplanterade djurceller mössa. En fluorescerande bild har overlayed på brightfield bilden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I den här filmen har vi visat vår version av klassiska tekniker som används av Xenopus biologer, som vi arrangeras för att skapa djuret analysen locket transplantation. Vid rumstemperatur Xenopus embryon utvecklas mycket snabbt genom olika stadier 9 och 15. Genom att placera dem vid 14 ° C, utvecklingen av embryot är långsammare och många fler transplantationer kan utföras i ett experiment. Om det är nödvändigt att växa de embryon som äldre stadier (> 42/43), då rekommenderar vi att använda transgena venus YFP djur, eftersom den injicerade fluorescerande tonar proteinet signal i äldre grodyngel. Vi använde denna analys för att fastställa att vävnaden djur mössa uttrycka EFTFs eller Noggin anges att bilda ögon-liknande vävnad. Denna analys kan användas som ett enkelt test för att fastställa huruvida en gen (er) av intresse är nödvändig för att bestämma en viss cell öde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från Forskning kring att förebygga blindhet (Career Development Awards MEZ och alkohol samt en obegränsad bidrag till Ögonkliniken), E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ och ASV) och National Eye Institute / NIH (MEZ , bidrag R01EY015748 och R01EY017964).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mMessage mMachine SP6 Kit Applied Biosystems AM1340
Borosilicate Capillary Tubes (1.0mm OD x 0.5mm ID) FHC, Inc. 27-30-1
Sutter Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Gentamicin sulfate [50 mg/ml] Fisher Scientific BW17-528Z
Sylgard/elastomer Kit 1.1lb Fisher Scientific NC9644388
60 x 15 mm polystyrene petri dish USA Scientific, Inc. 8609-0160
human chorionic gonadotropin Intervet Inc. 22219
Pico-Injector Microinjection Systems Harvard Apparatus 650003
Torrey Pines Scientific ECHOtherm Incubator Fisher Scientific 11-680-21
Transfer pipette Krackeler Scientific, Inc. 6290-20635A
Dumostar #5 Forceps Fisher Scientific 11295-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, W. C., Harland, R. M. Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos. Cell. 70, 829-840 (1992).
  2. Lamb, T. M. Neural induction by the secreted polypeptide noggin. Science. 262, 713-718 (1993).
  3. Green, J. Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish. Methods in Developmental Biology. Humana Press. Towata, N.J. (1999).
  4. Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).
  5. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, 905-909 (2005).
  6. Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (2008).
  7. Lan, L. Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. (2009).
Tissue Fastställande Använda Transplant Animal Cap (ACT) analys i<em> Xenopus laevis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).More

Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis. J. Vis. Exp. (39), e1932, doi:10.3791/1932 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter