Video bioinformatischen Analyse von humanen embryonalen Stammzellen Colony Growth

Summary

Video Bioinformatik ist die automatisierte Verarbeitung, Analyse, Verständnis und Data-Mining-biologischer räumlich-zeitliche Daten aus mikroskopischen Videos extrahiert. Der Zweck dieses Artikels ist es, ein Verfahren zur Messung an humanen embryonalen Stammzellen Kolonie Wachstum mit einem Video Bioinformatik Methode zu demonstrieren.

Abstract

Da Videodaten komplex und von vielen Bildern, Bergbau Informationen von Video-Material besteht nur schwer ohne Hilfe von Computer-Software zu tun. Video Bioinformatik ist eine mächtige quantitative Ansatz zur Gewinnung von räumlich-zeitlichen Daten von Video-Bildern mit Computer-Software, um aus Bergbau und Analyse durchzuführen. In diesem Artikel stellen wir ein Video Bioinformatik-Verfahren zur Quantifizierung des Wachstums von humanen embryonalen Stammzellen (hES) durch die Analyse von Zeitraffer-Videos in einer Nikon BioStation CT-Inkubator mit einer Kamera für Video-Bildgebung ausgestattet gesammelt. In unseren Experimenten wurden hESC Kolonien, die auf Matrigel befestigt wurden für 48 Stunden in der BioStation CT gefilmt. Zur Bestimmung der Wachstumsrate dieser Kolonien wurden Rezepturen entwickelt mit CL-Quant-Software, welche Benutzer auf verschiedene Arten von Daten von Videobildern zu extrahieren. Um genau zu beurteilen Koloniewachstum wurden drei Rezepte erstellt. Die erste segmentiert das Bild in der Kolonie und Hintergrund, die zweite erweiterte das Bild, um Kolonien in der Videosequenz genau zu definieren, und die dritte Messung der Anzahl der Pixel in der Kolonie im Laufe der Zeit. Die drei Rezepte wurden in Folge auf Video-Daten in einem BioStation CT gesammelt, um das Wachstum der einzelnen hESC Kolonien über 48 Stunden zu analysieren laufen. Um zu überprüfen, die Wahrhaftigkeit der CL-Quant Rezepte, waren die gleichen Daten manuell mit Hilfe von Adobe Photoshop-Software analysiert. Wenn die Daten mit dem CL-Quant Rezepte und Photoshop verglichen wurden erhalten, wurden die Ergebnisse praktisch identisch, was darauf hinweist das CL-Quant Rezepte wurden wahrheitsgetreu. Die hier beschriebene Methode könnte zu einer Video-Daten zu Wachstumsraten von menschlichen embryonalen Stammzellen oder andere Zellen, die in Kolonien wachsen beantragt werden. Darüber hinaus können andere Video Bioinformatik Rezepte in der Zukunft für andere zelluläre Prozesse wie Migration, Apoptose und Zelladhäsion entwickelt werden.

Protocol

Teil 1: Experimentelles

Video-Daten enthalten eine Fülle von Informationen. Allerdings ist diese Information oft nur schwer zu extrahieren und wenn manuell von Menschen gemacht und kann viele Stunden der Mitarbeiter Zeit benötigen, um abzuschließen. Manuelle Analyse von Menschen ist auch Gegenstand der Variation in der Interpretation und Irrtum. Video Bioinformatik beinhaltet die Verwendung von Computer-Software, um Daten aus Videobildern mir. Diese Methode der Analyse ist schnell und kann Fehler, wenn die Analyse wird manuell durch den Menschen geschieht tritt zu beseitigen. Der Zweck dieses Artikels ist es, ein Verfahren zur Quantifizierung mit humanen embryonalen Stammzellen Kolonie Wachstum mit einem Video Bioinformatik Methode zu demonstrieren.

In diesem Papier wurden Zeitraffer Video-Bilder unter Verwendung eines Nikon BioStation CT Inkubation Einheit, die mehrere Felder von Zellen im Laufe der Zeit abgebildet werden (Abb. 1) ermöglicht. Die Methoden in diesem Bericht beschrieben sind für Video-Daten von jedem Video mikroskopischen Aufbau gesammelt.

In unserem experimentellen Design, wir H9 hESC in 12-well-Zellkulturplatten für 48 Stunden überzogen. Während dieser Zeit wurden Kolonien erlaubt, voll anhängen und verbreiten auf Matrigel. Dann wurden die Platten mit angeschlossenem hESC Kolonien, die BioStation CT überführt und für weitere 48 Stunden. Während in den BioStation wurden Bilder von den Kolonien in 7 Minuten-Abständen entnommen und wurden später verwendet, um Zeitraffer-Video-Sequenzen erstellen. Videos für jede Kolonie wurden dann analysiert, um Wachstum der Kolonien mit Hilfe von Video Bioinformatik Rezepte mit dem CL-Quant-Software entwickelt zu quantifizieren. Die Analysen erfolgen mit Rezepten erstellt mit dem CL-Quant-Software wurden für Wahrhaftigkeit manuell mit Hilfe von Adobe Photoshop überprüft.

Teil 2: Herstellung von angehängten hESC Kolonien

1. Wachsen hESC auf Matrigel beschichteten 6-well Platten, und einmal 70% Konfluenz erreicht ist, replate eine Vertiefung der 6-Well-Platte in 5 Vertiefungen einer 12-well Matrigel beschichtete Platte wie folgt.
2. Absaugen Medium aus einem Brunnen mit menschlichen embryonalen Stammzellen.
3. Gut ausspülen 2x mit 1 ml PBS.
4. 1ml von Accutase und Inkubation für 1 Minute bei 37 ° C und 5% CO _2.
5. Add 10-12 Glasperlen in die Kavität der Platte vorsichtig, bis Kolonien vollständig aus dem Boden des Brunnens zu lösen.
6. Neutralisieren Accutase mit 1ml mTeSR mittel-oder MEF konditioniertem Medium.
7. Centrifuge der Zellsuspension in einer 15 ml konische Röhrchen bei 200 g für 3 Minuten.
8. Den Überstand und der Bruch Pellet mit 500μl frischer mTeSR Medium.
9. Platte tropfenweise 100 &mgr; des hESC Suspension in jedes Well in einer 12-Well-Platte.
10. Rock-Platte hin und her vorsichtig und beobachten Kulturen unter einem Lichtmikroskop. Stellen Sie sicher, dass Zellklumpen gleichmäßig über die Platte verteilt.
11. Platzieren Sie den 12-Well-Platte zurück in den Inkubator.
12. Lassen hESC zu befestigen und für 48 Stunden (eine kürzere Zeit eingesetzt werden) zu wachsen.
13. Nach 48 Stunden zu dekantieren die mittel-und Wasch-Brunnen mit 500 ul PBS entfernt ungebundene Zellen.
14. 1ml von mTeSR Medium in jede Vertiefung.
15. Kommentar: Sofort wird die Platte in den Brutschrank / Mikroskop für Videobearbeitung.
16. Beginnen Sie sammeln Zeitraffer-Bilder. Versuchen Sie, Felder mit diskreten einzelnen Kolonien, die nicht geeignet sind, in andere Kolonien wachsen zu wählen.
17. Andere Methoden zur Kultivierung und die Einrichtung hESC kann anstelle der oben genannten Protokoll verwendet werden.

Teil 3: Video Bioinformatik

CL-Quant-Software wurde benutzt, um drei "Rezepte", dass, wenn in Folge laufen die Pixelzahl oder ein Gebiet im Mikrometer für jede Kolonie im Laufe der Zeit bestimmen zu schaffen. Die drei Rezepte sind in Folge und für diese Anwendung gebaut sind Segmentierung, Optimierung und Messung.

Analysieren hESC Koloniewachstum mit dem CL-Quant-Software / Rezept Entwicklung:

1. Die Segmentierung Rezept zum ersten Mal erstellt.
2. Scannen Sie das gesamte Video, um sicherzustellen, dass das Video nutzbar ist. Überprüfen Sie, ob die gesamte Kolonie bleibt im Blickfeld und die anderen Kolonien nicht in den Bereich.
3. Öffnen Sie die Segmentierung Assistenten und klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter".
4. Wählen Sie das richtige Bild-Kanal (dh Phase, grün, rot, etc) und klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter".
5. Pick "soft matching" von den 3 Auswahlmöglichkeiten und klicken Sie auf "weiter".
6. Wählen Sie "wollen" Regionen durch Einkreisen Regionen auf das Bild in der Regel den äußeren Rand der Kolonie, um den zentralen Bereich der Kolonie.
   • Dieser Bereich sollte so klein wie möglich, sollte aber repräsentativ für die gesamte Kolonie.
   • Bei der Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie, müssen Sie den Ring um die Kolonie für präzise Kolonie Auswahl der Software enthalten.
   • Wählen Sie 1 oder 2-Regionen von Interesse, die zeigen, verschieden sein könnenPixelmuster innerhalb der Kolonie, aber nicht abholen zu viele "will", die zu ungenauen Maske Anwendung führen kann.
7. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter".
8. Wählen Sie "wollen nicht" Regionen durch Einkreisen Regionen auf das Bild, die nicht Teil der Kolonie und nicht Teil des Hintergrunds. Dies sind Regionen, die Muster, die Sie wünschen zu unterdrücken und zu zählen Pixel Artefakte wie Schmutz und abgestorbene Zellen zu haben. Klicken Sie auf "weiter".
9. Wählen Sie "Hintergrund" durch Einkreisen Regionen, die Sie wollen zu unterdrücken.
   • Die "nicht wollen" und "Hintergrund" Regionen unterscheiden sich in diesem Zusammenhang sollte einheitlich sein und wahrscheinlich zu zeigen, bis in jedem Frame.
   • Normalerweise wählen wir den grauen Hintergrund der ganzen Kolonie.
10. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter".
11. Eine farbige Maske sollte über Ihre Region of Interest (Abb. 2A) angezeigt werden.
12. Wenn die Maske nicht richtig decken den Bereich von Interesse, kann die Segmentierung Grenzbereich (an der rechten unteren Ecke der Software-Anzeige) erhöht oder verringert werden.
13. Die Segmentierung Assistent fordert für die weitere Maske Bereich Feinabstimmung, wenn nötig.
14. Wenn Sie Ihre Maske ändern möchten, wählen Sie "update soft passenden Regionen". Dies ermöglicht Ihnen, die "wollen", "wollen nicht" oder "Hintergrund" Bereichen zu ändern.
15. Wenn die Maske zufriedenstellend ist, wählen Sie "gelten Schwelle, und speichern Sie meine Maske", und klicken Sie auf die Schaltfläche "Weiter".
16. Die Maske wird dann in einer anderen Farbe dargestellt werden.
17. Wählen Sie "Fertig stellen".
18. Das Rezept sollte auf der rechten oberen Ecke der Software angezeigt werden, und es sollte als "Segmentierung Rezept" werden.
19. Benennen Sie das Rezept, wenn Sie mit einem rechten Mausklick und "Umbenennen" wollen.
20. Für Kontrolle vor Ort, der rechten Maustaste auf und platzieren Sie die Maus über "gelten Rezept".
21. Ein Menü wird zeigen, dass können Sie die Anzahl der Frames Sie wählen verwenden, wenn vor Ort die Überprüfung der Rezeptur. Führen Sie das Rezept für alle 10 Frames vor Ort überprüft die Richtigkeit der Maske Platzierung.
22. Wenn die Maske nimmt Teile des kleinen unerwünschte Regionen oder Trümmer, können Sie eine "Verbesserung Rezept" zur Verbesserung der Anpassung der Maske, um die Region von Interesse.
23. So erstellen Sie eine Verbesserung Rezept der rechten Maustaste auf die "Verbesserung Rezept"-Ordner, und klicken Sie dann auf "neu". Eine neue Erweiterung Rezept angezeigt werden sollen.
24. Von der ursprünglichen Field of View (FOV), klicken Sie auf "schaltet Erweiterungsmodul"-Taste auf der rechten Seite des Bildes. Maus über die Symbole in der Symbolleiste, um die richtige zu identifizieren.
25. Wählen Sie "Etikettierung" Dropdown-Menü.
26. Wählen Sie "Kennzeichnung 4 verbunden."
27. Wählen Sie "Beschriftung 4 connected2".
28. Eine neue Task-Leiste angezeigt werden soll.
29. Schnappen ersten Maske (mask0) aus der Segmentierung Rezept und ziehen Sie es auf der "Input"-Box.
30. Die Bar sollte nun "Eingabemaske #".
31. Ziehen Sie das Symbol mit dem "Eingabemaske #" auf der Maske 0-Symbol.
32. Find "min Größe" in der Taskleiste und stellen Zahl, bis nur noch region of interest wird angezeigt. Achten Sie darauf, auf "Ausführen" durch jede passende Studie klicken.
33. Wenn Sie mit Ihren Mindestgröße Einstellung zufrieden sind, auf die "Verbesserung Rezept", die Sie vorher erstellt haben klicken. (Abb. 2B)
34. Am unteren Rand des Bildschirms, wählen Sie "Ziel speichern unter Rezept".
35. Die Software fordert nun zu "überschreiben ausgewählte Rezept?", Wählen Sie "Ja"
36. Kontrolle vor Ort die Erweiterung Rezept mit den gleichen Verfahren wie oben für Stichprobenmessungen Segmentierung.
37. Wenn die Segmentierung und die Verbesserung Rezepte zufrieden sind, wählen "zu schaffen Messung Vorlage" auf der rechten Symbolleiste.
38. Benennen Sie die Vorlage, wenn Sie es wünschen.
39. Bei der Messung Template-Fenster, bewegen Sie den Cursor über clipart Zelle Figur. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und markieren Sie die Zelle.
40. Deaktivieren Sie die Option "Standard-Parameter 'und check' Bereich Parameter" unter "Morphologie".
41. Exit 'template' Fenster.
42. Wählen Sie das Symbol in der Messung Rezept erstellt.
43. Benennen Sie das Rezept.
44. Gehen Sie zu und wählen Sie "Vorlage" in der oberen rechten Ecke.
45. Drag-and-Drop Ihre zuvor erstellten Messung Schablone auf das Messfenster.
46. Klicken Sie auf "Ja", um fortzufahren.
47. Bei der Messung Rezept Fenster "Zuordnungen Channel 'wählen, dann" Whole cell'.
48. Wählen Sie "Mask Mappings".
49. Wählen Sie dann "Whole cell 'Option für die erweiterte Mask.
50. Wählen Sie die "Measurement Rezept" unter dem Rezept Registerkarte im Hauptfenster.
51. Wählen Sie den "Speichern"-Symbol in der Mess-Rezept Fenster.
52. Dann schließen Sie das Fenster.
53. Nun, schließen und öffnen die "FOV".
54. Rechtsklick auf das "Rezept"-Symbol, wählen Sie 'Lock Rezept Liste' und führen Sie die Rezepte nacheinander auf Ihre Video-Daten.

Teil 4: Prüfung Rezept Genauigkeit mit der Photoshop-Software

Zur Validierung der Rezeptur mit (CL-Quant Softw erstelltsind), können die gleichen Daten manuell mit Adobe Photoshop analysiert werden. Für diese Analyse wurde jeder 10. Frame (alle 70 Minuten-Zeitpunkt) analysiert, um Koloniegröße über 48 Stunden zu messen.

1. Öffnen Sie ein Bild von einer Kolonie Bild in Adobe Photoshop.
2. Klicken Sie auf den Zauberstab in der Werkzeugleiste.
3. Klicken Sie auf den Bereich um die Kolonie so den gesamten Bereich mit Ausnahme der Kolonie Region abgedeckt wird.
4. Klicken Sie in der Symbolleiste "im Maskierungsmodus bearbeiten" und klicken Sie auf die Kolonie so der Kolonie gewählt.
5. Achten Sie darauf, die gepunktete Linie um die Kolonie passt genau um die Peripherie der Kolonie und nicht in seinem Inneren. Wenn die gepunktete Linie ist nicht an der Peripherie, ändern Sie den Toleranzwert in der oberen Symbolleiste entsprechend.
6. Gehen Sie auf die 'Window' Pull-Down Menü und klicken Sie auf 'Histogramm'.
7. Notieren Sie sich die Pixel-Wert, wenn cache = 1. Wenn Cache ist 2, klicken Sie auf den '!' zum Cache-1 zu ändern, und notieren Sie den Pixelwert.
8. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden 10. Frame. Insgesamt weniger Frames verwendet werden, wenn gewünscht.
9. Die gesammelten Daten mit Hilfe von Photoshop und CL-Quant-Software kann dann gemeinsam dargestellt werden. Wenn die CL-Quant Rezepte ehrlich sind, sollten die Kurven für die Photoshop-und CL-Quant-Analyse sehr ähnlich sein (Abb. 3-5).
10. Wenn die Rezepte mit CL-Quant entwickelt ehrlich sind, können sie sicher an andere Video-Daten angewendet werden.
11. Der Wert im Umgang mit Video Bioinformatik in dieser Analyse ist, dass sobald die Segmentierung, Optimierung und Messung Rezepte entwickelt und validiert, so wird die Analyse sehr viel schneller und genauer als ein Mensch mit Photoshop durchzuführen.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1: Film Streifen eines hESC Kolonie der Frames darstellen kann zu verschiedenen Zeiten während 48 Stunden Wachstum in einem BioStation CT. Frames wurden bei 7 Minuten-Intervallen entnommen.

Abbildung 2: (A) Bild eines menschlichen embryonalen Stammzellen mit einer Maske auf der Kolonie durch die Segmentierung Rezept platziert. Bereiche von Schutt und Hintergrund sind auch maskiert darauf hinweist, dass eine Erweiterung Rezept benötigt wird, um die Genauigkeit der Auswertung zu verbessern. (B) Bild von der gleichen Kolonie wie in "A" nach Verbesserung gezeigt hat, durchgeführt. Die Maske wählt nun nur die Kolonie und Lärm aus der Auswahl wurden eliminiert.

Abbildung 3: Graph zeigt Anstieg der Kolonie Größe (in Pixel) über 48 Stunden bestimmt mit CL-Quant-Software und Photoshop. Dieser Graph wird die Rohdaten und zeigt, dass Kolonien in verschiedenen Größen zu starten. Es zeigt auch, dass beide Messverfahren in guter Übereinstimmung sind.

Abbildung 4: Graph zeigt die gleichen Daten wie in Abbildung 3 nach der Normalisierung der prozentualen Erhöhung der Kolonie Größe über 48 Stunden zeigen. Dies zeigt, dass die Wachstumsraten ähnlich sind, unabhängig von Beginn Kolonie Größe und dass beide Maßnahmen der Analyse zu ähnlichen Ergebnissen.

Abbildung 5: Graph zeigt die Mittel für die normalisierten Daten in Abbildung 4. Dieser Graph zeigt deutlich eine gute Übereinstimmung zwischen den Analysen, die mit Hilfe von Video Bioinformatik (CL-Quant-Software) und Photoshop und legt fest, dass das Rezept der Wahrheit entsprechen. Der leichte Rückgang im Bereich der Photoshop-Daten bei Bild 325 ist aufgrund mehrerer Videos nicht in den Photoshop Analyse einbezogen.

Discussion

Video Bioinformatik-Werkzeuge sind für die schnelle Extraktion von Daten aus Videobildern mächtig. Unser Protokoll zur Quantifizierung hESC Kolonie Wachstum zeigt eine Anwendung von Video Bioinformatik an ein biologisches Problem. Diese Methode ist quantitativ und hat die interessante Eigenschaft Erschließen von Daten aus den einzelnen hESC Kolonien. Video Bioinformatik Rezepte entwickelt, um andere zelluläre Prozesse wie Proliferation, Migration, Apoptose und Zell-Bindung an das Substrat, und Zelladhäsion auf angrenzende Zellen zu überwachen. Die Genauigkeit der Rezepte entwickelt mit CL-Quant-Software wurde validiert mit Photoshop und es wurde festgestellt, wahrhaftig zu sein. Sobald die entsprechenden Rezepte entwickelt werden, können Video-Daten aus beliebigen Quellen sehr schnell analysiert werden. Die benötigte Zeit, um Video-Daten mit Hilfe von Video Bioinformatik-Tools zu analysieren ist wesentlich kleiner als die Zeit für die Analyse von Hand mit Photoshop durchgeführt benötigt. Darüber hinaus wird die Analyse durch den Computer durchgeführt weniger fehleranfällig, da der Computer die Daten analysieren, wird die gleiche Weise jedes Mal, während ein Mensch Durchführung einer Analyse Fehler oder etwas anders Urteile zu fällen kann jeder Zeit ein Bild analysiert. Obwohl nicht als Teil dieses Protokoll diskutiert, können Videos auch für morphologische Veränderungen in der Kolonie untersucht werden. Dieser Parameter würde nützlich sein, in Fällen, in denen Behandlungsgruppen sind enthalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).