Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Summary

Vídeo bioinformática é o tratamento automatizado, análise, compreensão e de mineração de dados biológicos de espaço-temporal de dados extraídos de vídeos microscópica. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para medir-tronco embrionárias humanas crescimento da colônia de células usando um método de vídeo bioinformática.

Abstract

Como os dados de vídeo são complexos e são compostos de muitas imagens, informações de mineração a partir de material de vídeo é difícil de fazer sem o auxílio de software de computador. Vídeo bioinformática é uma poderosa abordagem quantitativa para a extração de dados espaço-temporais a partir de imagens de vídeo usando o software de computador para executar a mineração de namoro e análise. Neste artigo, apresentamos um vídeo bioinformática método para quantificar o crescimento de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) através da análise tempo-lapso vídeos coletados em um BioStation Nikon CT incubadora equipado com uma câmera para imagens de vídeo. Em nossos experimentos, colônias CTEh que foram anexadas a Matrigel foram filmados por 48 horas no CT BioStation. Para determinar a taxa de crescimento dessas colônias, as receitas foram desenvolvidas utilizando CL-Quant software que permite aos usuários extrair vários tipos de dados a partir de imagens de vídeo. Para avaliar com precisão o crescimento da colônia, três receitas foram criadas. A primeira imagem segmentada para a colônia e de fundo, o segundo a imagem do maior para definir colônias ao longo da sequência de vídeo com precisão, eo terceiro medido o número de pixels na colônia ao longo do tempo. As três receitas foram executadas em seqüência em dados coletados em um vídeo CT BioStation para analisar a taxa de crescimento de colônias CTEh individual sobre 48 horas. Para verificar a veracidade das receitas CL-Quant, os mesmos dados foram analisados ​​manualmente, usando o software Adobe Photoshop. Quando os dados obtidos com as receitas CL-Quant e Photoshop foram comparados, os resultados foram praticamente idênticos, indicando as receitas CL-Quant eram verdadeiras. O método descrito aqui pode ser aplicado a todos os dados de vídeo para medir as taxas de crescimento de CTEh ou outras células que crescem em colônias. Além disso, as receitas outro vídeo bioinformática podem ser desenvolvidos no futuro para outros processos celulares como a migração, apoptose e adesão celular.

Protocol

Parte 1: Procedimento Experimental

Dados de vídeo contêm uma abundância de informações. No entanto, esta informação é muitas vezes difícil de extrair e quando feita manualmente por seres humanos e pode requerer muitas horas de tempo pessoal para ser concluído. Análise manual por seres humanos também está sujeito a variação de interpretação e de erro. Vídeo bioinformática envolve o uso de software de computador para o meu dados específicos a partir de imagens de vídeo. Este método de análise é rápida e pode eliminar o erro que ocorre quando a análise é feita manualmente por seres humanos. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para quantificar-tronco embrionárias humanas crescimento da colônia célula usando um método de vídeo bioinformática.

Neste trabalho, as imagens de vídeo em tempo lapso foram coletados usando um Nikon BioStation unidade de incubação CT que permite que vários campos de células a ser trabalhada ao longo do tempo (Fig. 1). Os métodos descritos neste relatório são aplicáveis ​​a dados de vídeo recolhidas por qualquer vídeo microscópicos configurar.

Em nosso projeto experimental, banhado a H9 CTEh em 12 placas de cultura de tecidos bem por 48 horas. Durante este intervalo, as colônias foram autorizados a prender totalmente e espalhar sobre Matrigel. Então, as placas com colônias CTEh anexado foram transferidos para o CT BioStation e incubados por um período adicional de 48 horas. Enquanto no BioStation, imagens das colônias foram coletadas em intervalos de 7 minutos e depois foram usados ​​para criar seqüências de lapso de tempo de vídeo. Vídeos para cada colônia foram então analisados ​​para quantificar o crescimento de colônias com receitas de vídeo bioinformática desenvolvido com o software CL-Quant. As análises realizadas com receitas criadas com o software CL-Quant foram verificados quanto à veracidade manualmente usando o Adobe Photoshop.

Parte 2: Preparação de colônias CTEh anexado

1. CTEh crescer em Matrigel revestido 6-bem pratos, e uma vez confluência de 70% for atingido, Refaça um poço da placa de seis poços em cinco poços de uma placa de 12 poços Matrigel revestido como se segue.
2. Aspirar meio de um CTEh bem que o contém.
3. Enxágüe bem 2x com 1ml de PBS.
4. Adicionar 1 ml de Accutase e incubar por 1 minuto a 37 ° C e 5% CO _2.
5. Adicionar 12/10 contas de vidro dentro do poço e agitar suavemente até a placa de colônias totalmente destacar do fundo do poço.
6. Neutralize Accutase utilizando 1ml de mTeSR médio ou médio MEF condicionado.
7. Centrifugar a suspensão de células em um tubo cônico de 15ml 200g por 3 minutos.
8. Decantar o sobrenadante eo pellet romper com 500μl de meio de mTeSR fresco.
9. 100μl placa queda sábios da suspensão CTEh em cada poço de uma placa de 12 poços.
10. Placa de rock e para trás suavemente e observar as culturas sob um microscópio de luz. Certifique-se que aglomerados de células são distribuídas uniformemente pela placa.
11. Coloque a placa traseira de 12 bem na incubadora.
12. Permitir CTEh para anexar e crescer por 48 horas (um tempo mais curto pode ser usado).
13. Após 48 horas, poços decantar a médio e lave com 500ul de PBS para remover as células solto.
14. Adicionar 1ml de meio de mTeSR a cada poço.
15. Comentário: Imediatamente coloque o prato na incubadora / microscópio para imagens de vídeo.
16. Iniciar a coleta de lapso de tempo imagens. Tente selecionar campos com discreta colônias único que não são susceptíveis de crescer em outras colônias.
17. Outros métodos de cultivo e criação CTEh pode ser usado no lugar do protocolo acima.

Parte 3: Vídeo Bioinformática

CL-Quant software foi usado para criar três "receitas" que, quando executado em seqüência, determinar o número de pixels ou área em microns para cada colônia ao longo do tempo. As três receitas são construídas em seqüência e para esta aplicação incluem segmentação, aprimoramento e medição.

Analisando o crescimento CTEh colônia usando o software CL-Quant / desenvolvimento receita:

1. A receita de segmentação é criado em primeiro lugar.
2. Digitalizar o vídeo inteiro para se certificar de que o vídeo é utilizável. Certifique-se de toda a colônia permanece no campo de visão e que outras colônias não entrar no campo.
3. Abrir o assistente de segmentação e clique no botão "avançar".
4. Selecionar o canal de imagem correta (ie, fase, verde, vermelho, etc) e clique no botão "avançar".
5. Escolha "matching soft" para fora das 3 opções e clique em "next".
6. Selecione "querem" regiões circundando regiões na imagem tipicamente da borda exterior da colônia para a área central da colônia.
   • Esta área deve ser o menor possível, mas deve ser representativa de toda a colônia.
   • Quando se utiliza a microscopia de contraste de fase, não se esqueça de incluir o halo ao redor da colônia para a seleção colônia precisa pelo software.
   • Escolha uma ou duas regiões de interesse que podem apresentar diferentespadrões de pixels dentro da colônia, mas não escolher muitos "quer" que pode resultar na aplicação de máscara imprecisas.
7. Clique no botão "avançar".
8. Selecione "não querem" regiões circundando regiões na imagem que não fazem parte da colônia e não faz parte do fundo. Estas são regiões que têm padrões que você deseja suprimir e incluir pixels de artefatos, tais como detritos e células mortas. Clique em "next".
9. Selecione "background" circulando por regiões que você deseja suprimir.
   • O "não quero" e "background" regiões diferem em que fundo deve ser uniforme e, provavelmente, para mostrar-se em cada quadro.
   • Normalmente nós selecionar o fundo cinza em torno da colônia.
10. Clique no botão "avançar".
11. Uma máscara colorida deve ser exibida ao longo da sua região de interesse (Fig 2A).
12. Se a máscara não precisa cobrir a região de interesse, a faixa de limiar de segmentação (localizado no canto inferior direito da tela do software) pode ser aumentada ou diminuída.
13. O assistente de segmentação prompts para o ajuste mais fino máscara de área, se necessário.
14. Se você deseja alterar a sua máscara, selecione "update macio regiões matching". Isso permite que você mude o "quero", "não quero", ou "background" áreas.
15. Se a máscara é satisfatória, selecione "aplicar limiar e salvar a minha máscara", e clique no botão "avançar".
16. A máscara será exibida em uma cor diferente.
17. Selecione "Concluir".
18. A receita deve ser exibido no canto direito superior do software, e deve ser chamado de "receita de segmentação".
19. Renomear a receita, se quiser com um clique direito e "renomear".
20. Para a verificação in loco, com o botão direito e coloque o mouse sobre "aplicar receita".
21. Um menu irá mostrar que permite que você selecione o número de quadros que você deseja usar quando no local verificando a receita. Executar a receita para todos os 10 quadros de detectar verificar a precisão da colocação da máscara.
22. Se a máscara pega peças de pequenas regiões indesejadas ou detritos, você pode criar uma "receita de melhoria" para melhorar a montagem da máscara para a região de interesse.
23. Para criar uma receita de melhoria, clique direito no "aprimoramento receita" pasta e clique em "novo". Uma receita nova melhoria deve ser exibido.
24. Do campo original de visão (FOV), clique no "aprimoramento alterna módulo" botão localizado à direita da imagem. Mouse sobre os ícones na barra de ferramentas para identificar a correta.
25. Selecione "rotulagem" menu dropdown.
26. Selecione "4 rotulagem conectado".
27. Selecione "rotulagem 4 connected2".
28. A nova barra de tarefas deve ser exibido.
29. Agarre máscara inicial (mask0) da receita de segmentação e arrastá-lo para o "input" caixa.
30. A barra deve agora mostrar "máscara de entrada #".
31. Arraste o ícone com a "máscara de entrada #" para o ícone de máscara 0.
32. Encontrar "tamanho min" na barra de tarefas e ajustar o número até única região de interesse é exibida. Certifique-se de clicar em "executar" através de cada um julgamento apropriado.
33. Quando estiver satisfeito com o seu ajuste de tamanho mínimo, clique sobre a "receita de melhoria" que você criou anteriormente. (Fig. 2B)
34. Na parte inferior da tela, selecione "salvar a receita".
35. O software agora pede para "substituir receita selecionada?", Selecione "sim"
36. Verificação in loco a receita aprimoramento utilizando os mesmos procedimentos acima para verificar a segmentação local.
37. Se estiver satisfeito com a segmentação e receitas acessório, selecione "criar modelo de medição" na barra de ferramentas do lado direito.
38. Mudar o nome do modelo para, se desejar.
39. Na janela de modelo de medição, mover o cursor sobre a figura clipart celular. Segure a tecla Ctrl e selecione a célula.
40. Desmarque a opção 'default parâmetro "e" parâmetro área' de seleção em "morfologia".
41. Exit 'modelo' janela.
42. Selecione o ícone criado na receita de medição.
43. Renomear a receita.
44. Mover e selecione 'modelo' guia no canto superior direito.
45. Arrastar e soltar o seu modelo de medição criados anteriormente para a janela de medição.
46. Clique em 'Sim' para continuar.
47. Na janela de receita de medição, selecione 'Canal mapeamentos', 'Whole célula' então.
48. Selecione 'Máscara mapeamentos.
49. Então a opção "célula Whole 'select para a máscara reforçada.
50. Selecione a "receita de Medição ', na guia Receita na janela principal.
51. Selecione a opção 'Save' ícone dentro da janela de receita de medição.
52. Em seguida, feche a janela.
53. Agora, fechar e reabrir o "FOV.
54. Clique direito a 'receita' ícone 'lista da receita Lock' selecionar e executar as receitas seqüencialmente em dados de vídeo.

Parte 4: Verificação de precisão receita utilizando o software Photoshop

A fim de validar a receita criada com (CL-Quant softwsão), os mesmos dados podem ser analisados ​​manualmente com o Adobe Photoshop. Para esta análise, cada frame 10 (a cada 70 min ponto de tempo) foi analisado para medir o tamanho colônia mais de 48 horas.

1. Abrir um quadro de uma imagem de colônia em Adobe Photoshop.
2. Clique na ferramenta Magic Wand na barra de ferramentas.
3. Clique sobre a área ao redor da colônia para o campo inteiro é coberto, exceto a região da colônia.
4. Clique em "Editar no Modo Máscara Rápida" na barra de ferramentas e clique na colônia para a colônia é selecionado.
5. Certifique-se que a linha pontilhada ao redor da colônia se encaixa direito em torno da periferia da colônia, e não dentro dela. Se a linha pontilhada não é em torno da periferia, altere o valor de tolerância na barra de ferramentas superior em conformidade.
6. Vá para a 'Janela' no menu suspenso e clique em "Histograma".
7. Anote o valor de pixel quando cache = 1. Se o cache é de 2, clique no botão '!' para mudar para cache 1 e anote o valor de pixel.
8. Repita o processo acima para cada frame 10. Menos frames total pode ser usado, se desejar.
9. Dados coletados usando o Photoshop e CL-Quant software pode então ser plotados juntos. Se as receitas CL-Quant são verdadeiras, as curvas para a análise Photoshop e CL-Quant deve ser muito similar (Figs. 3-5).
10. Se as receitas desenvolvidas com CL-Quant são verdadeiras, eles podem ser seguramente aplicada a dados de vídeo.
11. O valor em uso de vídeo bioinformática nesta análise é que uma vez que a segmentação, realce, e receitas de medição são desenvolvidos e validados, eles vão realizar a análise muito mais rapidamente e com mais precisão do que um ser humano usando o Photoshop.

Resultados representante

Figura 1: strip Film de uma colônia CTEh mostrando quadros em vários momentos durante 48 horas de crescimento em um CT BioStation. Quadros foram levados a 7 minutos.

Figura 2: (A) Imagem de um CTEh com uma máscara colocada sobre a colônia pela receita de segmentação. Áreas de detritos e de fundo também são mascarados, indicando que uma receita de melhoria é necessária para melhorar a precisão da avaliação. (B) Imagem da mesma colônia, como mostrado em "A" depois de aprimoramento foi realizado. A máscara agora seleciona apenas a colônia e do ruído foi eliminado da seleção.

Figura 3: Gráfico mostrando aumento no tamanho da colônia (em pixels) mais de 48 horas, conforme determinado utilizando CL-Quant software e Photoshop. Este gráfico plota os dados brutos e mostra que as colônias começam em tamanhos diferentes. Também mostra que ambos os métodos de medição estão em bom acordo.

Figura 4: Gráfico mostrando os mesmos dados como na Figura 3 após a normalização para mostrar o aumento percentual no tamanho da colônia mais de 48 horas. Isso mostra que as taxas de crescimento são semelhantes, independentemente do tamanho das colônias de partida e que ambas as medidas de análise dão resultados semelhantes.

Figura 5: Gráfico mostrando os meios para os dados normalizados na Figura 4. Este gráfico mostra claramente uma boa concordância entre a análise realizada com o vídeo de bioinformática (CL-Quant software) e Photoshop e estabelece que a receita é verdadeira. O ligeiro abrandamento da área para os dados de Photoshop no quadro 325 é devido a vários vídeos não ser incluído na análise Photoshop.

Discussion

Ferramentas de bioinformática de vídeo são poderosos para a rápida extração de dados de imagens de vídeo. Nosso protocolo para quantificar o crescimento de colônias CTEh demonstra uma aplicação de vídeo de bioinformática para um problema biológico. Este método é quantitativo e tem a característica interessante de dados que revelem a partir de colônias CTEh individual. Receitas de vídeo bioinformática pode ser desenvolvido para monitorar outros processos celulares como a proliferação, migração, apoptose e adesão celular ao substrato, e apego célula para células adjacentes. A precisão das receitas desenvolvidas utilizando CL-Quant software foi validado utilizando Photoshop e foi encontrado para ser verdadeiro. Uma vez que as receitas apropriadas são desenvolvidas, dados de vídeo de qualquer fonte pode ser analisado com muita rapidez. O tempo necessário para analisar os dados de vídeo usando o vídeo bioinformática ferramentas é significativamente menor do que o tempo necessário para a análise realizada por mão usando Photoshop. Além disso, a análise feita pelo computador é menos propenso a erros, como o computador irá analisar os dados da mesma forma a cada vez, enquanto um ser humano fazer uma análise pode cometer erros ou julgamentos ligeiramente diferente a cada vez que uma imagem é analisada. Apesar de não ser discutida como parte deste protocolo, vídeos também podem ser examinados para alterações morfológicas na colônia. Este parâmetro seria útil nos casos em que os grupos de tratamento estão incluídos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).