Summary
Видео биоинформатики является автоматизированной обработки, анализа, понимания и анализа данных биологических пространственно-временных данных, извлеченных из микроскопических видео. Целью данной статьи является демонстрация метода измерения человеческих эмбриональных стволовых клеток, роста колоний методом видео биоинформатики.
Abstract
Поскольку видеоданные сложны и состоят из многих изображений, добыча информации из видео материала, трудно обойтись без помощи компьютерных программ. Видео биоинформатики является мощным количественный подход для извлечения пространственно-временных данных из видео изображения с помощью компьютерного программного обеспечения для выполнения знакомства горно-анализа. В этой статье мы представляем метод видео биоинформатики для количественного роста человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК), анализируя покадровой видео, собранные в Nikon биостанции КТ инкубатор оснащен камерой для видео-изображений. В наших экспериментах чЭСК колоний, которые были прикреплены к Матригель были сняты в течение 48 часов в биостанции КТ. Для определения темпов роста этих колоний, рецепты были разработаны с использованием CL-Quant программное обеспечение, которое позволяет пользователям извлекать различные типы данных с видео изображениями. Чтобы точно оценить роста колоний, три рецепты были созданы. Первые сегментированные изображения в колонии и фона, второе расширение изображения для определения колоний по всему видеоряда точно, а третья измеряется количеством пикселей в колонии с течением времени. Три рецепта проводились последовательно на видео данных, собранных в биостанции КТ для анализа темпов роста отдельных колоний чЭСК более 48 часов. Чтобы убедиться в правдивости CL-Quant рецепты, те же данные были проанализированы вручную с помощью Adobe Photoshop программного обеспечения. Когда данные получены с помощью CL-Quant рецепты и Photoshop были сопоставлены результаты были практически идентичны, что указывает на CL-Quant рецепты были правдивыми. Описанный здесь метод может быть применен к любому видео данных для оценки темпов роста чЭСК или других клеток, которые растут в колониях. Кроме того, другие видео биоинформатики рецепты могут быть разработаны в будущем для других клеточных процессов, таких как миграция, апоптоза и клеточной адгезии.
Protocol
Часть 1: Экспериментальная процедура
Видео данные содержат обилие информации. Тем не менее, эта информация часто трудно извлечь и когда делать вручную человеком, и может потребоваться много часов времени персонала, чтобы закончить. Руководство анализа человеком также подлежит изменению в интерпретации и ошибок. Видео биоинформатики предполагает использование компьютерного программного обеспечения для моих конкретных данных с видео изображениями. Этот метод анализа происходит быстро и может устранить ошибку, которая возникает, когда анализ делается вручную человеком. Целью данной статьи является демонстрация метода для количественного эмбриональных стволовых клеток человека колонии роста с помощью метода видео биоинформатики.
В данной работе, времени истечения видео изображения были получены с помощью Nikon биостанции КТ инкубационный блок, который позволяет нескольким полям клеток для включения в образ с течением времени (рис. 1). Методы, описанные в этом докладе, применимы к видео-данных, собранных в любое видео микроскопические создана.
В нашей опытно-конструкторских, мы покрытием H9 чЭСК в 12-и культуре ткани пластин в течение 48 часов. В течение этого интервала, колонии были разрешены в полной мере присоединения и распространения на Матригель. Затем пластины с прикрепленными колонии чЭСК были переведены на биостанции КТ и выдерживают в течение дополнительных 48 часов. Хотя в биостанции, образы колонии были собраны на 7-минутными интервалами, а впоследствии были использованы для создания покадровой последовательности видео. Видео для каждой колонии затем были проанализированы с целью количественного роста колоний с помощью видео биоинформатики рецепты разработаны с CL-Quant программного обеспечения. Анализ осуществляется с помощью рецептов, созданных с CL-Quant программного обеспечения были проверены на достоверность вручную с помощью Adobe Photoshop.
Часть 2: Подготовка прилагается колонии чЭСК
- Расти чЭСК на Матригель покрытием 6-луночных, и как только 70% слияния будет достигнут, replate одну лунку 6-луночный планшет на 5 скважинах 12-а Матригель покрытием пластин следующим образом.
- Аспирируйте среды от хорошо содержащие чЭСК.
- Хорошо промыть 2 раза с 1 мл PBS.
- Добавить 1 мл Accutase и инкубировать в течение 1 минуты при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Добавить 10-12 стеклянные бусы в колодец и встряхните пластины мягко, пока колонии полностью оторваться от дна колодца.
- Нейтрализовать Accutase использованием 1 мл mTeSR средний или MEF кондиционированной среды.
- Центрифуга суспензии клеток в 15 мл коническую трубку на 200 г в течение 3 минут.
- Декантируйте супернатант и распада гранул с 500 мкл свежей среды mTeSR.
- Пластина падение мудрых 100 мкл чЭСК суспензии в каждую лунку в 12-луночного планшета.
- Рок пластину назад и вперед осторожно и соблюдать культуру под световым микроскопом. Убедитесь, что ячейка сгустки равномерно распределены по всей пластине.
- Место 12-луночного планшета обратно в инкубатор.
- Разрешить чЭСК собираются и размножаются в течение 48 часов (более короткие сроки могут быть использованы).
- Через 48 часа, сцедить скважин средней и промыть 500ul ФСБ, чтобы удалить одиноких клеток.
- Добавить 1 мл средней mTeSR в каждую лунку.
- Комментарий: Сразу же месте пластинки в инкубаторе / микроскоп для видео изображений.
- Начало сбора покадровой изображений. Попробуйте выбрать поля с дискретным одной колонии, которые вряд ли перерастет в других колониях.
- Другие методы культивирования и создание чЭСК может быть использован вместо выше протокол.
Часть 3: Видео Биоинформатика
CL-Quant программное обеспечение было использовано для создания трех "рецепты", что при запуске в последовательности определяет количество пикселей или область в мкм для каждой колонии с течением времени. Три рецепта построены в последовательности и для этого приложения включают сегментацию, улучшения и измерения.
Анализ чЭСК роста колоний использованием CL-Quant программное обеспечение / рецепт развития:
- Сегментация рецепт создан в первую очередь.
- Сканирование всего видео, чтобы убедиться, что видео может использоваться. Проверьте, чтобы вся колония остается в поле зрения, и что других колоний не выйти на поле.
- Открытое сегментации мастера и нажмите кнопку "Далее".
- Выберите правильный канал изображения (то есть, фаза, зеленый, красный и т.д.) и нажмите кнопку "Далее".
- Пика "мягкими соответствия" из 3 вариантов и нажмите кнопку "Далее".
- Выберите "хочу" регионов, обведя области на изображении обычно внешнему краю колонии в центральной части колонии.
- Эта область должна быть как можно меньше, но должны быть репрезентативными для всей колонии.
- При использовании микроскопии фазового контраста, не забудьте включить ореол вокруг колонии для точного выделения колонии программного обеспечения.
- Выберите 1 или 2-х регионах интересов, который может показывать разныепиксель модели в пределах колонии, но не выбирайте слишком много "хочет", которая может привести к неточным применение маски.
- Нажмите кнопку "Далее".
- Выберите "не хотят" регионов, обведя области на изображения, которые не входят в колонию и не является частью фона. Это регионы, которые имеют модели, которые вы хотите, чтобы подавить и включают в себя пиксели артефакты, такие как мусор и мертвых клеток. Нажмите кнопку "Далее".
- Выберите «фон», обведя регионов, которые вы хотите подавить.
- "Не хочу" и "фона" регионы отличаются тем, что фон должен быть однородным и, вероятно, чтобы показать в каждом кадре.
- Обычно мы выбираем серый фон вокруг колонии.
- Нажмите кнопку "Далее".
- Цветные маски должны быть показаны над вашей области интересов (рис. 2А).
- Если маска не точно охватывать область интереса, ассортиментной сегментации порога (находится в правом нижнем углу программного обеспечения дисплей) может быть увеличена или уменьшена.
- Сегментация мастер предложит для дальнейшего маску области тонкой настройки, если необходимо.
- Если вы хотите изменить свою маску, выберите "Обновление мягкой соответствующих регионов». Это позволяет изменить "хочу", "не хочу", или "фон" районы.
- Если маска удовлетворительное, выберите "Применить порог и спасти мою маску", и нажмите кнопку "Далее".
- Маски будут показаны в разные цвета.
- Выберите "Готово".
- Рецепт должен быть отображен в правом верхнем углу программного обеспечения, и он должен называться "сегментация рецепт».
- Переименовать рецепт, если вы хотите, щелкнув правой кнопкой и "переименовать".
- Для выборочных проверок, щелкните правой кнопкой мыши и место курсор мыши на "применить рецепт».
- Меню будет показано, что позволяет выбрать количество кадров, вы хотите использовать при выборочных проверок рецепт. Выполнить рецепт на каждые 10 кадров выборочной проверки точности маски размещения.
- Если маска поднимает отделах тонкого нежелательных регионов или мусора, вы можете создать "повышение рецепт" для улучшения подгонки маски области интереса.
- Чтобы создать повышения рецепт, щелкните правой кнопкой мыши "повышение рецепт" папку, а затем нажмите кнопку "новый". Новый рецепт повышения должны быть показаны.
- Из первоначального поля зрения (FOV), нажмите "переключает усиление модуля" кнопку, расположенную справа от изображения. Наведите курсор мыши на иконку в панели инструментов, чтобы определить правильный.
- Выберите "маркировки" выпадающего меню.
- Выберите "маркировки 4 связаны".
- Выберите "маркировки 4 connected2".
- Новая панель задач должны быть показаны.
- Захватите начальной маски (mask0) от сегментации рецепт и перетащить его на "вход" коробка.
- Бар должно отображаться "маски ввода #".
- Перетащите значок с "маски ввода #" к иконке маски 0.
- Найти "минимальный размер" в панели задач и корректировать количество пока единственный регион, интерес появится. Убедитесь, что вы нажимаете кнопку "выполнить" через каждую установку суда.
- Как только вы довольны своей минимальной регулировки размера, нажмите на "улучшение рецепт" Вы создали ранее. (Рис. 2В)
- В нижней части экрана, выберите "сохранить рецепт».
- Программное обеспечение теперь подсказывает "переписать выбранный рецепт?", Выберите "да"
- Выборочная проверка повышение рецепт, используя те же процедуры, что и выше для выборочных проверок сегментации.
- Если вы согласны с сегментацией и повышение рецепты, выберите "Создать шаблон измерения" на правой панели рукой.
- Переименование шаблона, если хотите.
- В окне шаблонов измерения, переместить курсор на фигуру ячейки клипарт. Нажмите клавишу Ctrl и выберите ячейку.
- Снимите флажок "параметров по умолчанию" и "площадь параметр 'проверить в разделе« Морфология ».
- «Шаблон» Выход окна.
- Выберите значок созданного в измерении рецепт.
- Переименовать рецепт.
- Перемещение и выберите вкладку "Шаблон" в верхнем правом углу.
- Перетащите созданный ранее шаблон на измерение измерение окна.
- Нажмите "Да", чтобы продолжить.
- В окне рецептов измерения, выберите "Канал отображения ',' Всего ячейки тогда.
- Выберите «Маска отображения.
- Тогда 'Всего ячейки выберите вариант для усовершенствованной маске.
- Выберите "Измерение рецепт" под Рецепт вкладке главного окна.
- Выберите "Сохранить" значок в окне рецепта измерений.
- Затем закройте окно.
- Теперь, закройте и снова откройте "поле зрения".
- Щелкните правой кнопкой мыши «рецепт» значке, выберите 'Lock рецепт список' и запустить рецепты последовательно на данных видео.
Часть 4: Проверка рецепт точностью с помощью программного обеспечения Photoshop
Для проверки рецептов, созданных с (CL-Quant обновлесть), те же данные могут быть проанализированы вручную с помощью Adobe Photoshop. Для этого анализа, каждый 10-й кадр (каждые 70 мин временной точке) были проанализированы для измерения колонии размером более 48 часов.
- Открытые рамки колонии изображения в Adobe Photoshop.
- Нажмите на Magic Wand Tool, на панели инструментов.
- Нажмите на область вокруг колонии так все поле покрыто за исключением колонии региона.
- Нажмите кнопку "Изменить в режиме быстрой маски" на панели инструментов и нажмите на колонию так колония выбрана.
- Убедитесь, что пунктирная линия вокруг колонии подходит прямо вокруг периферии колонии, а не внутри нее. Если пунктирная линия не на периферии, измените значение допуска в верхней панели инструментов соответственно.
- Перейти в "окно" выпадающем меню и нажмите кнопку "Гистограмма".
- Запишите значение пиксела, когда кэш = 1. Если кэш 2, нажмите кнопку '!' перейти на кэш 1 и запишите значение пикселя.
- Повторите описанный выше процесс для каждого десятого кадра. Меньше общего кадры могут быть использованы, если это необходимо.
- Данные собраны при помощи Photoshop и CL-Quant программное обеспечение может быть построена вместе. Если CL-Quant рецепты правдивой, кривые для анализа Photoshop и CL-Quant должны быть очень похожи (рис. 3-5).
- Если рецепты разработаны с CL-Quant правдивы, они могут быть надежно применить и к другим видеоданных.
- Значение в использовании видео биоинформатики в этом анализе, что как только сегментации, улучшения и измерения рецепты разработаны и утверждены, они будут выполнять анализ гораздо быстрее и точнее, чем человеческий использованием Photoshop.
Представитель Результаты
Рисунок 1: Фильм полосы чЭСК колонии показ кадров в разное время в течение 48 часов роста в биостанции КТ. Рамки были приняты на 7 минут.
Рисунок 2: () Изображение чЭСК с маской размещены на колонию сегментации рецепт. Области мусора и фоном также масках о том, что повышение рецепт, необходимых для повышения точности оценки. (Б) изображение одного и того же колонии, как показано в "" после повышения не было выполнено. Маска сейчас выбирает только колонии и шум был исключен из выбора.
Рисунок 3: График увеличения колонии размер (в пикселях) в течение 48 часов, как определяется с использованием CL-Quant программного обеспечения и Photoshop. Этот график участки исходных данных и показывает, что колонии начинаются в различных размерах. Это также показывает, что оба метода измерения находятся в хорошем согласии.
Рисунок 4: График же данные, что на рисунке 3, после нормализации, чтобы показать процентное увеличение в колонии размером более 48 часов. Это показывает, что темпы роста похожи, независимо от размера, начиная колонии, и что обе меры анализа дают близкие результаты.
Рисунок 5: График средства для нормированных данных на рисунке 4. Этот график наглядно показывает хорошее согласие между анализ делается с помощью видео биоинформатики (CL-Quant программное обеспечение) и Photoshop и устанавливает, что рецепт правдивыми. Небольшой спад в области для данных Photoshop в кадре 325 объясняется несколькими видео не включены в анализ Photoshop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Видео биоинформатики инструменты являются мощными для быстрого извлечения данных из видеоизображений. Наш протокол для количественного роста чЭСК колонии демонстрирует одно применение видео биоинформатики к одной биологической проблеме. Этот метод количественного и имеет интересную особенность выявления данных из отдельных колоний чЭСК. Видео биоинформатики рецепты могут быть разработаны для мониторинга других клеточных процессов, таких как пролиферации, миграции, апоптоза и клеточной прикрепления к субстрату, и клеточных вложений на соседние клетки. Точность рецепты разработаны с использованием CL-Quant программное обеспечение было проверяются с помощью Photoshop и оказалась правдивой. Как только соответствующие рецепты разработаны, видео данные из любого источника может быть проанализирован очень быстро. Время, необходимое для анализа видеоданных с использованием видео биоинформатики инструменты значительно меньше, чем время, необходимое для анализа, выполненного вручную, используя Photoshop. Более того, анализ, проведенный компьютер менее подвержены ошибкам, как компьютер будет анализировать данные точно так же каждый раз, в то время человека выполнять анализ может делать ошибки или слегка различных решений каждый раз изображение анализируется. Хотя это и не обсуждаться в рамках этого протокола, видео может также быть проверены на предмет морфологических изменений в колонию. Этот параметр будет полезно в случаях, когда лечение групп включены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Развитие этого метода стало возможным благодаря финансированию, связанные с табаком болезни Калифорнии Программа исследований, Калифорнийский Институт регенеративной медицины, и NSF IGERT грант на видео биоинформатики (# 0903667) в UCR ( http://www.cris.ucr .edu / IGERT / index.php ). Сабрина Лин поддерживается диссертации стипендий из отдела аспирантуры, Шон Forteno поддерживается NIH MARC стипендий и Shruthi Сатиш поддерживается стипендий дивизии. Мы благодарны Анне Trtchounian за ее помощь в подготовке цифры. Мы также благодарим Сэм Alworth и Нед Jastromb для нас учит, как использовать CL-Quant программного обеспечения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium | Stem Cell Technologies | 05850 | or any suitable medium for hESC culture. |
| BD Matrigel | BD Biosciences | 356234 | or other suitable substrate. |
| DMEM/F12 Basal Medium | Invitrogen | 11330-032 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | |||
| Accutase Enzyme Cell Detachment Medium | eBioscience | 00-4555-56 | or other suitable detachment enzyme. |
| 3mm Glass beads | Fisher Scientific | 11-312A | optional. |
| 12-well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | or any other plate format. |
| Nikon BioStation CT/IM | or other incubator/microscope suitable for collecting video data. | ||
| CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe). |
