Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Summary

Vídeo bioinformática es el tratamiento automatizado, análisis, comprensión y extracción de datos de la diversidad espacio-temporal de los datos extraídos de vídeos microscópicos. El propósito de este artículo es mostrar un método para medir humanos con células madre embrionarias crecimiento de la colonia con un método de vídeo bioinformática.

Abstract

Dado que los datos de vídeo son complejos y están compuestos de muchas imágenes, información de la minería de material de video es difícil de hacer sin la ayuda de programas informáticos. Vídeo bioinformática es un poderoso método cuantitativo para la extracción de datos espacio-temporales de las imágenes de vídeo con software de computadora para realizar la minería de data y el análisis. En este artículo, presentamos un método de vídeo bioinformática para cuantificar el crecimiento de las células madre embrionarias humanas (células madre) mediante el análisis de vídeos con lapso de tiempo recogido en una Nikon BioStation CT incubadora equipado con una cámara para obtener imágenes de video. En nuestros experimentos, las colonias de células madre que se adjunta a Matrigel se filmó durante 48 horas en el CT BioStation. Para determinar la tasa de crecimiento de estas colonias, las recetas fueron desarrollados usando CL-Quant de software que permite a los usuarios para extraer distintos tipos de datos de imágenes de vídeo. Para evaluar con precisión el crecimiento de colonias, tres recetas fueron creadas. La primera segmentación de la imagen en la colonia y el fondo, la segunda mayor de la imagen para definir las colonias a lo largo de la secuencia de vídeo con precisión, y el tercero mide el número de píxeles en la colonia con el tiempo. Las tres recetas se ejecutan en una secuencia de vídeo en datos recogidos en un CT BioStation para analizar la tasa de crecimiento de colonias de células madre individuales de más de 48 horas. Para comprobar la veracidad de las recetas CL-Quant, los mismos datos fueron analizados de forma manual utilizando el software Adobe Photoshop. Cuando los datos obtenidos mediante las recetas CL-Quant y Photoshop se compararon los resultados fueron prácticamente idénticos, lo que indica la receta CL-Quant eran veraces. El método descrito aquí se podría aplicar a los datos de vídeo para medir las tasas de crecimiento de las células madre u otras células que crecen en las colonias. Además, otra de vídeo recetas de la bioinformática se pueden desarrollar en el futuro para otros procesos celulares como la migración, la apoptosis y la adhesión celular.

Protocol

Parte 1: Procedimiento Experimental

Los datos de vídeo contienen una gran cantidad de información. Sin embargo, esta información es a menudo difícil de extraer y cuando se hace manualmente por los seres humanos y puede requerir muchas horas de tiempo del personal para completar. Manual de análisis por los seres humanos también está sujeto a la variación en la interpretación y el error. Vídeo bioinformática implica el uso de software para minería de datos específicos a partir de imágenes de vídeo. Este método de análisis es rápida y puede eliminar el error que se produce cuando el análisis se realiza de forma manual por los seres humanos. El propósito de este artículo es mostrar un método para la cuantificación de células madre embrionarias humanas crecimiento de la colonia con un método de vídeo bioinformática.

En este trabajo, el tiempo de las imágenes de vídeo lapso fueron recolectados a través de una Nikon BioStation unidad de incubación CT, que permite múltiples campos de las células para formar una imagen a través del tiempo (Fig. 1). Los métodos descritos en este informe son aplicables a los datos de video recogidas por cualquier vídeo microscópicas establecido.

En nuestro diseño experimental, plateado H9 células madre en 12 y placas de cultivo de tejido durante 48 horas. Durante este intervalo, las colonias se les permitió colocar totalmente y se extendió en Matrigel. A continuación, las placas con las colonias células madre adjunta fueron trasladados a la CT BioStation y se incubaron durante 48 horas. Mientras que en el BioStation, las imágenes de las colonias se recogieron a intervalos de 7 minutos y posteriormente fueron utilizados para crear lapso de tiempo las secuencias de vídeo. Videos de cada colonia se han analizado para cuantificar el crecimiento de colonias de vídeo utilizando recetas bioinformática desarrollados con el software CL-Quant. Los análisis realizados con recetas creadas con el software CL-Quant se comprueba la veracidad manualmente con Adobe Photoshop.

Parte 2: Preparación de las colonias de células madre adjunta

1. Crecer células madre en Matrigel recubierto placas de 6 pocillos, y una vez llegado a la confluencia del 70% es, replate un pocillo de la placa de 6 pocillos en 5 pozos de 12 y placa recubierta de Matrigel de la siguiente manera.
2. Aspirar medio de un pozo que contiene células madre.
3. Enjuague bien con 2x 1 ml de PBS.
4. Añadir 1 ml de Accutase e incubar durante 1 minuto a 37 ° C y 5% de CO _2.
5. Añadir 10-12 perlas de vidrio en el pozo y agitar suavemente la placa por completo hasta que las colonias se desprenden de la parte inferior del pozo.
6. Neutralizar Accutase con 1 ml de mTeSR medio o medio MEF acondicionado.
7. Se centrifuga la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml a 200 g por 3 minutos.
8. Se decanta el sobrenadante y el precipitado romper con 500μl de medio mTeSR fresco.
9. Placa 100μl gota a gota de la suspensión de células madre en cada pocillo de una placa de 12 pocillos.
10. Placa de roca de ida y vuelta con cuidado y observar cultivos bajo un microscopio de luz. Asegúrese de que grupos de células se distribuyen uniformemente a lo largo de la placa.
11. Vuelva a colocar la placa de 12 pocillos en la incubadora.
12. Permitir células madre para unir y crecer durante 48 horas (un tiempo más corto puede ser utilizado).
13. Después de 48 horas, los pozos se decanta el medio y lavar con 500 ul de PBS para eliminar las células sueltas.
14. Añadir 1 ml de medio mTeSR a cada pocillo.
15. Comentario: Colocar la placa en la incubadora / microscopio en busca de imágenes de vídeo.
16. Comenzar a recopilar imágenes con lapso de tiempo. Trate de seleccionar los campos con discretas colonias aisladas que no tienen posibilidades de crecer en otras colonias.
17. Otros métodos para el cultivo y la creación de células madre se pueden utilizar en lugar del protocolo anterior.

Parte 3: Vídeo Bioinformática

CL-Quant de software se utiliza para crear tres "recetas" que cuando se ejecuta en secuencia determinará el número de píxeles o el área en micras para cada colonia con el tiempo. Las tres recetas se basan en la secuencia y para esta aplicación son la segmentación, la mejora y medición.

Análisis del crecimiento de colonias células madre utilizando el software CL-Quant / desarrollo de recetas:

1. La receta de segmentación se crea en primer lugar.
2. Escanear el vídeo entero para asegurarse de que el vídeo se puede utilizar. Compruebe que toda la colonia se queda en el campo de visión y que otras colonias no entran en el campo.
3. Abra el asistente de segmentación y haga clic en el botón "Siguiente".
4. Seleccione el canal de la imagen correcta (es decir, la fase verde, rojo, etc) y haga clic en el botón "Siguiente".
5. Pick "juego suave" de las 3 opciones y haga clic en "siguiente".
6. Seleccione "quieren" las regiones con un círculo las regiones en la imagen general, el borde exterior de la colonia a la zona central de la colonia.
   • Esta área debe ser lo más pequeña posible, pero debe ser representativo de toda la colonia.
   • Cuando se utiliza la microscopía de contraste de fase, asegúrese de incluir el halo alrededor de la colonia para la selección precisa de colonias por el software.
   • Elige una o dos regiones de interés que pueden mostrar diferentespatrones de pixeles dentro de la colonia, pero no recoge muchos "quiere" que puede resultar en la aplicación de la máscara inexacta.
7. Haga clic en el botón "Siguiente".
8. Seleccione "No quiero", las regiones con un círculo en la imagen de las regiones que no forman parte de la colonia y no forman parte del fondo. Estas son las regiones que tienen patrones que desea suprimir e incluir píxeles de artefactos tales como los desechos y células muertas. Haga clic en "siguiente".
9. Seleccione "fondo" con un círculo las regiones que desea suprimir.
   • El "no quiero" y "de fondo" las regiones se diferencian en que el fondo debe ser uniforme y probabilidad de aparecer en cada marco.
   • Normalmente, se selecciona el fondo de color gris alrededor de la colonia.
10. Haga clic en el botón "Siguiente".
11. Una máscara de color se debe mostrar en la región de interés (Fig. 2A).
12. Si la máscara no se precisa cubrir la región de interés, el rango del umbral de segmentación (que se encuentra en la esquina inferior derecha de la pantalla del software) puede ser aumentado o disminuido.
13. El asistente le pedirá la segmentación para afinar aún más fina máscara de área si es necesario.
14. Si usted desea cambiar de máscara, seleccione "Actualización suave regiones con el tema". Esto le permite cambiar el "querer", "no quiero", o las zonas "de fondo".
15. Si la máscara es satisfactoria, seleccione "solicitar umbral y salvar a mi máscara", y haga clic en el botón "Siguiente".
16. La máscara se mostrará en un color diferente.
17. Seleccione "Finalizar".
18. La receta se debe mostrar en la esquina superior derecha del software, y que debería ser llamado "receta de la segmentación".
19. Cambiar el nombre de la receta, si lo desea haciendo clic derecho y "rename".
20. Para comprobar in situ, haga clic derecho y colocar el puntero del ratón sobre "aplicar la receta".
21. Un menú aparecerá que le permite seleccionar el número de fotogramas que desea utilizar al lugar el control de la receta. Ejecutar la receta de cada 10 marcos para comprobar in situ la exactitud de la colocación de la máscara.
22. Si la máscara recoge piezas de pequeñas regiones no deseados o basura, se puede crear una "receta de mejora" para mejorar la colocación de la máscara de la región de interés.
23. Para crear una fórmula de mejora, haga clic con la "receta de mejora" carpeta y haga clic en "nuevo". Una receta nueva mejora se debe mostrar.
24. Desde el campo original de visión (FOV), haga clic en la "mejora cambia el módulo" situado a la derecha de la imagen. Ratón encima de los iconos en la barra de herramientas para identificar la correcta.
25. Seleccione "etiquetado" en el menú desplegable.
26. Seleccione "4 de etiquetado conectado".
27. Seleccione "etiquetado 4 connected2".
28. Una nueva barra de tareas se debe mostrar.
29. Coge la máscara inicial (mask0) de la receta de segmentación y arrastrarlo a la "entrada".
30. La barra debería mostrar ahora "máscara de entrada #".
31. Arrastre el icono de la "máscara de entrada #" al icono de la máscara de 0.
32. Encontrar el "tamaño mínimo" en la barra de tareas y ajustar el número hasta la región de interés sólo se muestra. Asegúrese de hacer clic en "ejecutar" a través de cada ensayo de montaje.
33. Una vez que esté satisfecho con el ajuste de tamaño mínimo, haga clic en la "receta de mejora" que ha creado previamente. (Fig. 2B)
34. En la parte inferior de la pantalla, seleccione "guardar la receta".
35. El software ahora le pide a "sobrescribir receta seleccionada?", Seleccione "sí"
36. Comprobar in situ la receta de mejora utilizando los mismos procedimientos que el anterior para la segmentación de punto de comprobación.
37. Si está satisfecho con la segmentación y la mejora de las recetas, seleccione "crear una plantilla de medición" en la barra de herramientas de mano derecha.
38. Cambiar el nombre de la plantilla si lo desea.
39. En la ventana de la plantilla de medición, mueva el cursor sobre la figura de células clipart. Mantenga presionada la tecla Ctrl y seleccione la celda.
40. Desactive la opción por defecto de los parámetros "y" del área de parámetros "de verificación en« morfología ».
41. Exit 'plantilla' de la ventana.
42. Seleccione el icono creado en la receta de medición.
43. Cambiar el nombre de la receta.
44. Desplazarse y seleccionar pestaña "Plantilla" en la esquina superior derecha.
45. Arrastre y suelte su plantilla creada previamente la medición en la ventana de medición.
46. Haga clic en 'Sí' para continuar.
47. En la ventana de la receta de medición, seleccione "Canal asignaciones", "células enteras ', entonces.
48. Seleccione 'Máscara de asignaciones ".
49. Entonces 'de células enteras "seleccione la opción de máscara mejorada.
50. Seleccione la "receta de medición" en la pestaña de recetas en la ventana principal.
51. Seleccione la opción "Guardar" icono en la ventana de recetas de medición.
52. A continuación, cierre la ventana.
53. Ahora bien, cerrar y reabrir el 'campo de visión.
54. Haga clic en la 'receta' icono 'lista de bloqueo receta "seleccionar y ejecutar las recetas de forma secuencial en los datos de vídeo.

Parte 4: Comprobación de la precisión de recetas utilizando el software Photoshop

Con el fin de validar la receta creada con (CL-Quant softwson), los mismos datos se pueden analizar de forma manual con Adobe Photoshop. Para este análisis, cada fotograma 10 (70 min cada punto del tiempo) fue analizada para medir el tamaño de la colonia de más de 48 horas.

1. Abrir un cuadro de una imagen de la colonia en Adobe Photoshop.
2. Haga clic en la herramienta Varita mágica en la barra de herramientas.
3. Haga clic en el área alrededor de la colonia por lo que el campo está cubierto excepto la región de colonia.
4. Haga clic en 'Editar en modo Máscara rápida "en la barra de herramientas y haga clic en la colonia por lo que la colonia se ha seleccionado.
5. Asegúrese de que la línea de puntos alrededor de la colonia encaja perfectamente en la periferia de la colonia y no en su interior. Si la línea de puntos no está en la periferia, cambie el valor de tolerancia en la barra de herramientas superior en consecuencia.
6. Ir a la "ventana" del menú desplegable y haga clic en "Histograma".
7. Anote el valor del píxel cuando cache = 1. Si la caché es de 2, haga clic en el '!' a cambio de un caché, y anote el valor del píxel.
8. Repita el proceso anterior para cada fotograma 10. Menos cuadros en total se pueden utilizar si lo desea.
9. Los datos recolectados a través de Photoshop y el software CL-Quant se pueden trazar en conjunto. Si las recetas CL-Quant son veraces, las curvas para el análisis de Photoshop y CL Quant-deben ser muy similares (Figs. 3-5).
10. Si las recetas desarrolladas con CL-Quant son veraces, se pueden aplicar a los datos de forma fiable de vídeo.
11. El valor en el uso de la bioinformática de vídeo en este análisis es que una vez que la segmentación, la mejora, y las recetas de medición se han desarrollado y validado, que se llevará a cabo el análisis mucho más rápidamente y con mayor precisión que un ser humano con Photoshop.

Resultados representante

Figura 1: Tira de película de una colonia de células madre que muestra imágenes en distintos momentos durante las 48 horas de crecimiento en un CT BioStation. Marcos fueron tomadas en intervalos de 7 minutos.

Figura 2: (A) Imagen de una células madre con una máscara que se coloca en la colonia por la receta de la segmentación. Zonas de escombros y de fondo también son enmascarados lo que indica que una receta de la mejora es necesaria para mejorar la precisión de la evaluación. (B) Imagen de la misma colonia, como se muestra en "A" después de la mejora se ha realizado. La máscara de ahora sólo selecciona la colonia y el ruido ha sido eliminado de la selección.

Figura 3: Gráfico que muestra el aumento de tamaño de la colonia (en píxeles) más de 48 horas como se determina utilizando CL-Quant de software y Photoshop. Este gráfico muestra los datos en bruto y muestra que las colonias empiezan en diferentes tamaños. También muestra que los dos métodos de medición están en buen acuerdo.

Figura 4: Gráfico que muestra los mismos datos que en la Figura 3 después de la normalización para mostrar el porcentaje de incremento en el tamaño de la colonia de más de 48 horas. Esto demuestra que las tasas de crecimiento son similares, independientemente del tamaño de la colonia de partida y que tanto las medidas de análisis dan resultados similares.

Figura 5: Gráfico que muestra los medios para que los datos normalizados en la Figura 4. Este gráfico muestra una buena concordancia entre los análisis realizados utilizando el vídeo bioinformática (CL-Quant de software) y Photoshop, y establece que la receta es la verdad. La ligera disminución en el área para los datos de Photoshop en el fotograma 325 se debe a varios videos que no se incluyeron en el análisis de Photoshop.

Discussion

Vídeo herramientas bioinformáticas son potentes para la rápida extracción de datos de imágenes de vídeo. Nuestro protocolo para cuantificar el crecimiento de células madre colonia demuestra una aplicación de vídeo de bioinformática para un problema biológico. Este método es cuantitativo y tiene la característica interesante de los datos que revelan de las colonias de células madre individuales. Vídeo recetas bioinformática se pueden desarrollar para controlar otros procesos celulares como la proliferación, la migración, la apoptosis y la adhesión celular al sustrato, y la adhesión celular a las células adyacentes. La precisión de las recetas desarrolladas con CL-Quant software fue validado el uso de Photoshop y se encontró que ser veraz. Una vez que las recetas apropiadas se desarrollan, los datos de cualquier fuente de vídeo se pueden analizar muy rápidamente. El tiempo necesario para analizar los datos de vídeo con herramientas de vídeo bioinformática es significativamente menor que el tiempo necesario para el análisis realizado a mano con Photoshop. Por otra parte, el análisis realizado por el equipo es menos propenso a errores, ya que el equipo analizará los datos de la misma manera cada vez, mientras que un humano que realiza un análisis puede cometer errores o fallos ligeramente diferente cada vez que se analiza una imagen. Aunque no se discute como parte de este protocolo, videos también se pueden examinar los cambios morfológicos en la colonia. Este parámetro sería útil en los casos en los grupos de tratamiento se incluyen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
mTeSR1 Human Embryonic Stem Cell Maintenance Medium	Stem Cell Technologies	05850	or any suitable medium for hESC culture.
BD Matrigel	BD Biosciences	356234	or other suitable substrate.
DMEM/F12 Basal Medium	Invitrogen	11330-032
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+
Accutase Enzyme Cell Detachment Medium	eBioscience	00-4555-56	or other suitable detachment enzyme.
3mm Glass beads	Fisher Scientific	11-312A	optional.
12-well Tissue Culture Plates	BD Biosciences	353043	or any other plate format.
Nikon BioStation CT/IM			or other incubator/microscope suitable for collecting video data.
CL-Quant software (Nikon) and/or Photoshop (Adobe).