Summary
Магнитная система модуляции биодатчиков используется для быстрого, чутко и просто обнаруживать биологические анализы, такие как молекулы ДНК и белков.
Abstract
Модуляции магнитного биодатчиков системы (ММБ) [1,2] быстро и равномерно обнаружено биологических мишеней при низких концентрациях без мытья или стадии разделения. Когда IL-8 целевых присутствовал, "sandwich' основе анализа прилагается магнитных шариков с IL-8 захвата антитела к стрептавидин связаны флуоресцентного белка с помощью IL-8 цели и биотинилированного IL-8 антител. Магнитного бисер маневрировал в колебательное движение, применяя переменного градиента магнитного поля с помощью двух электромагнитных полюсов. Флуоресцентные белки, которые прилагаются к магнитных шариков конденсируются в области обнаружения и их движение в и из ортогональных лазерный луч производит периодические флуоресцентный сигнал, демодулированный использованием синхронного детектирования. Магнитная система биодатчиков модуляции ранее был использован для выявления кодирующих последовательностей из неструктурных Ибараки вирусного белка 3 (NS3) комплементарной ДНК (кДНК) [2]. Методы, которые демонстрируются в этой работе для внешних манипуляций и конденсации частиц могут быть использованы для других применений, например, поставка магнитно-связанных наркотиков
Protocol
ИЛ-8 анализа:
- Реакционной смеси включены следующие четыре компонента в 100 мкл конечного объема буфера в соответствующих концентрациях. 10 мкл магнитных шариков с захватом антител при 100 бусин / мкл конечных концентрациях, 2 мкл биотинилированного IL-8 антител на 1 nano-gram/μl конечной концентрации, 1 мкл стрептавидин флуоресцентного белка при 20 nano-gram/μl конечной концентрации, и 1 мкл IL-8 цель на 0,48 pico-gram/μl. Компоненты добавляются один за другим буфером и затем встряхивают в течение 30 минут.
- Контрольной реакции готовят так же, без IL-8 цели.
- Реакции позже помещен без каких-либо разделения или стиральную шаг в кювет и проверить при помощи MMB системы.
MMB системы:
- Место кювету в его положение между двумя электромагнитными полюсами.
- Эксплуатация модуляции тока и подождите 30 секунд, чтобы позволить агрегации и конденсации бисером
- Измерить сигнал синхронный усилитель с помощью осциллографа.
Представитель Результаты:
Визуальный осмотр агрегированных бисером представили четкое различие между реакцией с мишенью и реакции без цели. Во всех реакциях с мишенью, бусин формируется единый плотный агрегат, который переехал в и из лазерного луча таким образом, объединиться. Однако во всех реакции без цели, бусины были менее агрегированных и их движение было менее объединиться (см. Рисунок 1).
Рисунок 1: визуальный осмотр иммуноанализа сэндвич '() без целевой ИЛ-8 (б) с целевой IL-8.
Часы полюс модуляции (желтый) и PMT выходного сигнала (пурпурный) при обнаружении 0,48 грамма пико-IL-8 целевых представлены на рисунке 1 (а). Частота модуляции для каждого полюса с частотой 2 Гц. Однако, как это было теоретически ожидать, когда бусины проходит лазерный луч, PMT обнаруживает флуоресцентный свет, и есть пик в PMT выходного напряжения. Таким образом, демодуляция частоты с частотой 4 Гц. Когда ФЭУ сигнал и удвоил-модуляции частоты (с частотой 4 Гц) подают к замку усилителем, чувствительным детектором фазы обнаруживает синхронизации и результатов с высоким напряжением (см. Рисунок 2).
Рисунок 2: (а) модуляции часы (желтый) и ФЭУ сигнал (пурпурный) при обнаружении 0,48 грамма пико-IL-8 цели. (Б) привели блокировки усилитель напряжения на двух разных сканов.
Замок в усилителе не обнаружили никакого сигнала, когда контрольный образец был испытан. Этот факт, вместе с визуальной разницы в агрегации показывает, что система MMB может точно определить присутствие ИЛ-8 цели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Таким образом, мы показали, что система MMB может быть использован для обнаружения присутствия IL-8 целевой при низких концентрациях (0,5 пико грамм предел обнаружения Bio-Plex Precision Pro анализах цитокинов [3,4]). Способность системы не ограничивается IL-8 и может быть использован для обнаружения других белков. Преимущества системы MMB являются способность обнаруживать цель быстро и без каких-либо отделения или промывки. Таким образом, это облегчает процесс обнаружения и позволяет системе, которые будут использоваться в полевых условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Ishaya Горовиц фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set | Bio-Rad | 171-B5008M | |
| Recombinant human IL-8 target | Thermo Fisher Scientific, Inc. | R202625 | |
| Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 | BD Biosciences | 554718 | |
| Streptavidin coupled fluorescent protein | Bio-Rad | Streptavidin PE |
References
- Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation. Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).
- Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation. Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).
- Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel". , Bio-Plex Pro. Forthcoming.
- Instruction Manual. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.
