Summary
यह प्रोटोकॉल तीन वर्णन
Abstract
Protocol
1. परिचय
इस वीडियो में, हम प्रदर्शन करेंगे कैसे रहते हैं और फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं पर एक ध्यान के साथ इमेजिंग immunohistochemistry के लिए तैयार करने के लिए ड्रोसोफिला दिमाग और retinae . सबसे पहले, हम दिखा देंगे कि कैसे मस्तिष्क dissections के लिए तैयार करने के लिए. अगला, हम दो बुनियादी सामान्यतः immunohistochemistry के लिए इस्तेमाल किया dissections कि जीने की तैयारी के लिए आधार के रूप में प्रदर्शन करेंगे. इन दोनों की तैयारी वयस्क दिमाग और आंख dissections हैं. अगला, हम photoreceptors के रहते इमेजिंग के लिए उनके उपयोग पर जोर देने के साथ वयस्क और विकासशील मस्तिष्क के रहते इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता dissections का प्रदर्शन करेंगे. अंत में, हम हम कैसे छवि रहते ऊतक का वर्णन और गुंजयमान confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग रहते इमेजिंग के कुछ उदाहरण दिखा होगा.
2. विच्छेदन तैयारी
- अच्छा dissections के लिए, आप तेज संदंश की जरूरत है. एक sharpening ब्लॉक या बहुत ठीक रेत कागज (1500) का प्रयोग, धीरे संदंश आगे और पीछे जब तक प्रत्येक पक्ष पर समाप्त होता है एक ठीक बिंदु पर मिलने से गुजारें. हम एक मानक sharpening पत्थर का उपयोग करें. हम sharpening यहाँ तकनीक को कवर नहीं है, लेकिन कृपया ध्यान दें कि तेज संदंश रहते dissections के लिए आवश्यक हैं. हम हर विच्छेदन के पहले संदंश पैनापन.
- वयस्क दिमाग के लिए dissections, सीओ 2 के लिए उन्हें anesthetize और बाहर वांछित जीनोटाइप सॉर्ट पैड पर मक्खियों जगह है . Pupal dissections के लिए, बस शीशी में पहुँचने के लिए और ध्यान से अपने संदंश के साथ एक कोषस्थ कीट निकालने के लिए, pupal मामले को तोड़ने से बचने के सावधान किया जा रहा है.
- पानी के साथ एक Kimwipe गीला. आप विच्छेदन के दौरान इस का उपयोग करने के लिए अपने संदंश से मलबा हटाने जाएगा. स्टिरियोस्कोप के मंच पर एक पकवान विदारक स्थिति और यह HL3 एक समाधान के साथ भरने. सभी dissections HL3 में आयोजित किया जाएगा करने के लिए सुनिश्चित करें कि जीवित ऊतक और विच्छेदन की प्रक्रिया के दौरान स्वस्थ रहता है. इसके अलावा, हम एक विच्छेदन पकवान है कि Sylgard के नीचे कवर करने के लिए विच्छेदन के दौरान संदंश की रक्षा का उपयोग करें.
- अब, फिक्सिंग के समाधान अगर आप immunohistochemistry प्रदर्शन की योजना तैयार करते हैं. HL3 की एक 500μL microcentrifuge ट्यूब में प्लेस 180μL. 3.7% formaldehyde समाधान प्राप्त करने के 37% formaldehyde के 20μL जोड़ें.
- अंत में, उचित हाथ की स्थिति अच्छी dissections के लिए महत्वपूर्ण है. अच्छा हाथ की स्थिति के साथ, अपने संदंश स्थिर और नियंत्रित, सूक्ष्म आंदोलनों में सक्षम हो जाएगा. सबसे पहले, अपने अंगूठे की ओर संदंश जगह है. फिर तर्जनी सीधे जैसे कि उंगली की नोक के शीर्ष पर टिकी हुई है नीचे लाने के लिए. अब अपने बीच की उँगली की तरफ संदंश की ओर आराम और विच्छेदन पकवान के लिए कदम. पकवान के साथ अपने अंगूठे और मध्यम उंगली के द्वारा भौतिक संपर्क करें. जबकि पकवान पर अपने अंगूठे और मध्यम उंगली आराम, खुर्दबीन मंच पर अपनी कलाई संयंत्र. इस तरह, आप तीन अंक विच्छेदन के दौरान सतहों पर मजबूती से लगाए और यह अब संभव है संदंश के बहुत ही सूक्ष्म जोड़तोड़ बनाने है. इस तकनीक को पहली बार में थोड़ा अजीब लग रहा है, लेकिन अभ्यास के साथ, आप जल्द ही मस्तिष्क dissections के एक मालिक हो जाएगा.
3. वयस्क दिमाग
- सीओ 2 पैड पर, एक वयस्क उन्मुख सिर के साथ अपने हाथ से दूर वेंट्रल पक्ष मक्खी. बस सिर के नीचे छाती पकड़ो. अगर ठीक से किया है, पैर और सूंड का विस्तार होगा. जबकि एक स्टिरियोस्कोप के तहत देखने, अपने संदंश के साथ विस्तारित सूंड को हड़पने के लिए सिर हटायें. शरीर और सिर डूब त्यागें. जलमग्न सिर पर Refocus. पूरे विच्छेदन समाधान के तहत प्रदर्शन किया जाएगा. यह बहुत महत्वपूर्ण है हर समय संदंश के साथ सिर पर पकड़ है. अन्यथा, सिर नाव और को पुनः प्राप्त करने के लिए मुश्किल है. अगर सिर ध्यान से बाहर विच्छेदन के दौरान चलता है, बस इसे वापस खुर्दबीन समायोजन के बिना फोकल हवाई जहाज़ में कदम. यह प्रतीत होता है सरल काम मुश्किल में पहली बार हो सकता है, लेकिन हो सकता है अपने सिर को ध्यान में रखते हुए समय के साथ आसान हो जाएगा.
- पहले सूंड और आंख के बीच संयोजी ऊतक फाड़ विच्छेदन शुरू करो. आंखों के माध्यम से फाड़ जबकि हर समय कम से कम एक संदंश के साथ मजबूती से पकड़े. निश्चित है कि संदंश के पैर की अंगुली केवल रेटिना या छल्ली नीचे सिर्फ मस्तिष्क नीचे हानिकारक से बचने के. छोड़ दिया और सही बारी, अपने संदंश का उपयोग करने के लिए रेटिना दूर आंसू, सिर के पीछे की ओर काम कर रहे हैं. दूर रेटिना फाड़ संभावना है कि इस विच्छेदन भर में ऑप्टिक पालि से जुड़ी लामिना रहता वृद्धि होगी. सिर के पीछे के चारों ओर जारी रखें, रास्ते छल्ली फाड़. दूसरी आँख के माध्यम से फाड़ और दूर छल्ली खींच शुरू करते हैं. के रूप में लंबे समय के रूप में आप छल्ली कब्जाने रहे हैं, आप जानते हैं आप मस्तिष्क नहीं कुचल कर रहे हैं! मन में इस के साथ, छल्ली और रेटिना दूर खींच जब तक मस्तिष्क से पता चला है जारी है.
- एक बार मस्तिष्क दिखाई देता है, आप निकालना ट्रेकिआ मस्तिष्क (छवि 1A) से जुड़ी शुरू कर सकते हैं. जारी रखें जब तक मस्तिष्क अलग है ट्रेकिआ और छल्ली में खींच. इस बिंदु पर, आप टी के लिए अपने पकवान के नीचे करने के लिए refocus चाहिएवह चरणों शेष. क्योंकि आपके मस्तिष्क अन्यथा रातोंरात एंटीबॉडी washes के दौरान नाव हो सकता है शेष ट्रेकिआ निकालें. फोटोरिसेप्टर टर्मिनलों की इमेजिंग के लिए, यह लामिना बनाए रखने के लिए वांछनीय है, लेकिन आप रेटिना है, जो सेल निकायों और दृढ़ता autofluorescent वर्णक को दूर करने की जरूरत है. ऐसा करने के लिए, ध्यान लामिना को नुकसान पहुँचाए बिना जंगली और pigmented सेलुलर बनी हुई है पर खींच. यह एक बेहतर कौशल और अभ्यास लेता है.
- वयस्क दिमाग घंटे या दिन स्थिति है कि हम 6 अनुभाग में चर्चा करेंगे का उपयोग करने के लिए जीवित रखा जा सकता है. Immunohistochemistry के लिए, वयस्क दिमाग अब formaldehyde में तय होने के लिए तैयार 2. P20 5μL करने के लिए सेट pipetteman प्रयोग फिक्सिंग समाधान आप पहले से ही तैयार है वयस्क दिमाग चाल. 20 मिनट के लिए वयस्क दिमाग विदारक जारी रखें, जो 4-10 दिमाग की उपज चाहिए. एक अतिरिक्त 40 मिनट के लिए तय करने में दिमाग को छोड़ दो, लेकिन इस अवधि इष्टतम प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला के लिए भिन्न हो सकते हैं. Formaldehyde समाधान निकालें और दिमाग 400μL पीबीएस और 0.4% TritonX 100, इसके बाद पीबीएस - ट्राइटन रूप में संदर्भित युक्त समाधान में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार धोने. पूरी तरह से तय समाधान धोने के बाद, आप प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ सकते हैं.
4. वयस्क आँख
- इस विच्छेदन शुरू के रूप में वयस्क दिमाग के लिए वर्णित है. सिर submerging और refocusing खुर्दबीन के बाद, सूंड और आंख के बीच संयोजी ऊतक फाड़ द्वारा शुरू करते हैं. सूंड के ऊपर, आंख से छल्ली अलग. अब, आंखों के नीचे से अलग छल्ली, सिर के पीछे की ओर काम कर रहे है. एक संदंश के साथ, सिर के पीछे के केंद्र ले लो. दूसरे के साथ, नजर हड़पने के लिए और खींच. आँख पकवान के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए (छवि 1B) की अनुमति दें. लामिना शायद अभी भी आंख के लिए संलग्न करेंगे और इस समय पूरी तरह से बरकरार फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं के टर्मिनलों के रहते इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. फोटोरिसेप्टर सेल शरीर के रहते इमेजिंग के साथ जारी रखने के लिए, 4.5 अनुभाग में जाओ. अगले तीन वर्गों तय आँख immunohistochemistry समझाओ.
- Immunohistochemistry के लिए, एक P20 5μL करने के लिए सेट pipetteman का उपयोग कर समाधान फिक्सिंग के आंख चाल है. 10 मिनट की कुल के लिए वयस्क आँखों विदारक जारी रखें. तय करने में एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए आँखों को छोड़ दें. तय समाधान और washes के आचरण के रूप में वयस्क दिमाग विच्छेदन में वर्णित निकालें.
- यदि आप अंततः छवि के लिए आंख की ommatidial संरचना इच्छा लामिना अब हटा दिया जाना चाहिए. अपने विदारक पकवान तय आँखें वापसी और हटाने के किसी भी ट्रेकिआ या चर्बी कोशिकाओं है कि अभी भी संलग्न किया जा सकता है. अगला, जबकि एक संदंश के साथ आंख के बाहर पकड़े, दूसरे के साथ लामिना हटा दें. यह बंद एक टुकड़ा में आते हैं, नीचे cellbodies उजागर (छवि 1B) चाहिए. लामिना केवल हड़पने के लिए सावधान रहें! अन्यथा, आप रेटिना से detaching photoreceptors जोखिम.
- एक P20 pipetteman का प्रयोग, एक 500uL ट्यूब में पीबीएस ट्राइटन 400uL आँखें चाल. धीरे से 4 डिग्री पर उन्हें रातोंरात रॉक photoreceptors से autofluorescent लाल रंग को हटाने. अगले दिन, तुम धोने समाधान त्यागें और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ सकता है.
- वयस्क आँखों के रहते इमेजिंग के लिए हम केवल pharate वयस्क मक्खियों का उपयोग करें, शीघ्र ही देर मंच pupae eclosion पहले अर्थात्. इस स्तर पर, फोटोरिसेप्टर सेल विच्छेदन के दौरान लामिना में टर्मिनलों से अलग निकायों.
- Pharate वयस्क pupae अच्छी तरह से परिभाषित पंख, आँखें, और pupal मामले के माध्यम से दिखाई छल्ली है. एक कोषस्थ कीट का चयन करें और pupal मामले की पूर्वकाल भाग को दूर करने के लिए सिर क्षेत्र का पर्दाफाश. ध्यान पतली भीतरी झिल्ली है कि अतिरिक्त विकासशील मक्खी encloses हटा दें. अपने संदंश और पुल के साथ सिर के आधार पकड़ो. कोषस्थ कीट के बाकी त्यागें जबकि सिर जलमग्न रखने.
- Immunohistochemistry के लिए आंख विच्छेदन में प्रदर्शन के रूप में आगे बढ़ें. Pharate वयस्क अवस्था में, तथापि, फोटोरिसेप्टर सेल शरीर और अधिक आसानी से लामिना से अलग है, आप सेल रेटिना में बसे शरीर छवि के लिए अनुमति होगी. इसके अलावा, लामिना ऑप्टिक पालि से जुड़े रहता है, आप बाहर का लामिना छवि करने की अनुमति है. यदि आप छवि को प्रॉक्सिमल लामिना, जहां फोटोरिसेप्टर टर्मिनल कारतूस देखा जा सकता है चाहते हैं, तो एक वयस्क मक्खी जहां लामिना और अधिक दृढ़ता से आँख करने के लिए जुड़ा हुआ है पर नजर विच्छेदन प्रदर्शन.
5. आँख डिस्क मस्तिष्क परिसरों का विकास
- 20% pupal विकास (पी 20%) के विकास पर आँख डिस्क हमारी प्रयोगशाला में रहते इमेजिंग के लिए एक पसंदीदा बन गया है क्योंकि अपेक्षाकृत बड़े विकासशील कोशिकाओं के इस एकल परत आसानी से confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूदार है 3.
- एक 20% कोषस्थ कीट का चयन करें, malpighian tubules pupal मामले के नीचे प्रकट होता है एक हरे रंग की जगह के लिए देखो, और से बचने pupae है कि एक "अंधेरे शरीर" 4. HL3 में अपने विदारक डिश में 20% पी कोषस्थ कीट, डूब यह चुनने के बाद और ध्यान से pupal बोरी के पूर्वकाल हिस्सा निकालने के लिए, सावधान किया जा रहापतली भीतरी झिल्ली घुसना नहीं. अपने संदंश के साथ भीतरी झिल्ली समझ और अलग खींच.
- ध्यान से जारी की सामग्री के माध्यम से खोज करने के लिए विकासशील मस्तिष्क और आंख डिस्क जो काफी प्रमुख हैं (छवि 1C) मिल. आँख जटिल डिस्क मस्तिष्क आसानी से कायापलट के इस स्तर पर अलग है. मस्तिष्क विदारक डिश के तल पर अलग. ध्यान ऑप्टिक पालि से केंद्रीय मस्तिष्क अलग. ऑप्टिक डिस्क / पालि आँख रहते इमेजिंग में इस्तेमाल किया जाएगा.
6. खुर्दबीन से कम: इमेजिंग लाइव
- यदि आप केवल एक या दो समाधान में समय की एक छोटी अवधि के लिए छवि के लिए चाहते हैं, तो आप एक गिलास स्लाइड पर अपने ऊतक छवि हो सकती है. इस मामले में, पहली कोटिंग Sylgard सतह के साथ निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर स्लाइड तैयार है. HL3 20μL स्लाइड के मध्य में रखें. 20 HL3 के अतिरिक्त स्लाइड μL में अपना dissected ऊतक परिवहन. ऊतक हवा करने के लिए कभी नहीं उजागर करना चाहिए. इसके अलावा, किसी भी विंदुक हैंडलिंग या समाधान सतह तनाव से तनाव या तनाव से बचा जाना चाहिए.
- रहते इमेजिंग के लिए, ऊतक मजबूती न्यूनतम हैंडलिंग और संपर्क के साथ सुरक्षित किया जाना चाहिए. हम सुरक्षित पानी polymerizing शल्य चिकित्सा गोंद microelectrode के माध्यम से लागू GluShield का उपयोग मस्तिष्क की स्थिति, एक तकनीक नियमित रूप से 5 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए भ्रूण की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए खींच लिया उन लोगों की तरह एक गिलास इलेक्ट्रोड प्राप्त करते हैं. बंद टिप तोड़ और GluShield नकारात्मक हवा मुँह से उत्पन्न दबाव का उपयोग कर के साथ अंत भरें. केवल इलेक्ट्रोड है कि गोंद दर्ज कर सकते हैं के लिए पर्याप्त तोड़ो. अब सकारात्मक HL3 की एक बूंद के तहत Sylgard करने के लिए गोंद की एक छोटी राशि लागू दबाव उपयोग करें. अब, जल्दी से गोंद पर ऊतक सेट रहते इमेजिंग के लिए वांछित उन्मुखीकरण को बनाए रखने. अब एक पानी विसर्जन लेंस इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि आप एक झिल्ली पारगम्य डाई जोड़ना चाहते हैं, तो आप इसे इमेजिंग जबकि स्नान करने के लिए जोड़ सकते हैं.
- हम एक गूंजनेवाला स्कैनिंग confocal खुर्दबीन है कि photobleaching कम कर दिया. इमेजिंग के लिए समय या विनिमय समाधान के लिए लंबी अवधि में 6 पूरी तरह से या कई बार, हम एक छिड़काव चैम्बर (हार्वर्ड IC30 confocal इमेजिंग चैम्बर) जो एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप को जोड़ता का उपयोग के साथ तेजी से इमेजिंग की अनुमति देता का उपयोग करें है कि धीरे धीरे रहते ऊतक पर संस्कृति समाधान perfuses (2A छवि). लगातार तरल मुद्रा और न्यूनतम GluShield संपर्क आंदोलन के ऊतक कि 7 समय की लंबी अवधि में देखा गया है की सपाट कम. ध्यान दें कि विकासात्मक समय अवधि के इमेजिंग के लिए, आंख डिस्क मस्तिष्क जटिल बरकरार रहेगा और गोंद के साथ कम से कम संपर्क करना चाहिए था की जरूरत है.
- एक कवर Sylgard है कि यह पतली और फ्लैट सौंपनेवाला मुंडा है की एक बूंद के साथ लेपित पर्ची का उपयोग करें. Coverslip और गोंद Sylgard के लिए जीना ऊतक के केंद्र पर HL3 20μL बग़ैर. एक गैसकेट है कि बुलबुले कक्ष के माध्यम से हवा (छवि 2B) के लिए जीना ऊतक उजागर किए बिना पारित करने के लिए अनुमति देगा उत्पन्न करता है. गैस्केट काफी मोटी ऊतक लेकिन काफी पतली confocal खुर्दबीन लेंस के करीब ऊतक लाने कुचल से बचने के लिए किया जाना चाहिए, हम हमारे सेटअप में 250μm उपयोग. छिड़काव चैम्बर इकट्ठा, हर समय पूरी तरह से जलमग्न ऊतक रखने के लिए सावधान किया जा रहा है. प्रति मिनट की दर करीब 100μL एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप का उपयोग कर छिड़काव शुरू शुरू. इस गति के बजाय तेजी से गैसकेट मोटाई है कि कक्ष ऊंचाई को परिभाषित करता है पर निर्भर करता है. घंटे के पैमाने पर इमेजिंग के लिए, आप 20 hydroxyecdysone और एंटीबायोटिक, लेकिन नहीं ऐंटिफंगल जोड़ने के लिए, और प्रति मिनट 10μl के आसपास बहुत कम गति पर छिड़काव प्रदर्शन की आवश्यकता हो सकती है. अंत में, हम मध्यम संस्कृति है कि छिड़काव चैम्बर की आपूर्ति में बुलबुला ऑक्सीजन.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
हमारे वीडियो प्रोटोकॉल के अंत में हम विकासशील फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में धारा 5 में प्रस्तुत की तैयारी का उपयोग रहते इमेजिंग के लिए एक उदाहरण दिखाते हैं. यह तैयारी सेल विशेष रूप से फ्लोरोसेंट संवाददाताओं को व्यक्त करने के लिए ड्रोसोफिला transgenesis का लाभ लेता है . झिल्ली टैग myrRFP और endosomal 2xFYVE - GFP 9 मार्कर: दिखाए गए उदाहरण में, दो फ्लोरोसेंट संवाददाताओं फोटोरिसेप्टर विशिष्ट जीएमआर Gal4-8 ड्राइवर के नियंत्रण के तहत व्यक्त कर रहे हैं . दो चैनल 70x70x17.5μm की एक bounding बॉक्स और 137x137x700nm (512x512x26) के एक voxel आकार के साथ 3 डी डेटासेट हर 1 मिनट प्राप्त किया गया. फिल्म इस 4D डाटासेट है कि intracellular endosomal तस्करी और पुटिका संलयन घटनाओं की गतिशीलता का पता चलता है में एक समय पर चयनित विमान से पता चलता है. आंख और लामिना तय ऊतक की तैयारी के लिए छवियों प्रतिनिधि छवि में दिखाया गया हैं. 3.
Discussion
प्रतिदीप्त इमेजिंग के लिए खेतों में प्रयुक्त किए गए जांच
यहाँ हम तीन वर्गों से फ्लोरोसेंट जांच के चयन के लिए ड्रोसोफिला दृश्य प्रणाली तैयारी की शक्तियों और सीमाओं का वर्णन: (1) जांच है कि एक जीवित ऊतक exogenously तैयारी के लिए जोड़ रहे हैं, (2) फ्लोरोसेंट प्रोटीन है कि आनुवंशिक रूप से दोनों रहते हैं और के लिए इनकोड किया गया है तय इमेजिंग, (3) फ्लोरोसेंट रंजक है कि immunohistochemistry के लिए तय ऊतक करने के लिए जोड़ रहे हैं.
1. Exogenous जांच:
Lysotracker DND-26 या DND 99 लाल ग्रीन (Invitrogen इंक) इन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं फ्लोरोसेंट झिल्ली पारगम्य यौगिकों कि सेल, सबसे प्रमुखता lysosomes में मजबूती acidified डिब्बों में जमा है, देर endosomes, और autophagosomes . Nanomolar सांद्रता (हम आम तौर पर 50 एनएम का उपयोग) पर Lysotracker कम से कम एक मिनट में पूरी तरह से L3 और पी 20% आँख डिस्क प्रवेश. के बाद से लगातार Lysotracker जम जाता है और कम से कम 5 मिनट में एक alkalizing प्रभाव, हम छवि डाल रही है. आँख डिस्क के विपरीत, Lysotracker ऊतकों के विघटन के बिना मस्तिष्क घुसना नहीं करता है. हालांकि, बाहरी झिल्ली के फाड़ सावधान ऑप्टिक पालि में कुछ सेल diameters के प्रवेश की अनुमति देता है.
Lysosensor DND Lysotracker करने के लिए इसके विपरीत में 189 (Invitrogen इंक), Lysosensor acidified डिब्बों में नहीं जमा करता है, लेकिन प्रदर्शन अम्लीय pH में प्रतिदीप्ति वृद्धि हुई है. Lysosensor पैठ विशेषताओं है कि बहुत Lysotracker करने के लिए इसी तरह की हैं है. हम 1μM की एकाग्रता पर Lysosensor का उपयोग करें.
2. आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जांच:
कई रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए, हम GFP, 10 TagRFP या पीएच संवेदनशील द्विआधारी Gal4/UAS अभिव्यक्ति 12 प्रणाली के नियंत्रण के तहत 11 pHluorin जैसे विभिन्न फ्लोरोसेंट अणु के साथ टैग जीनों व्यक्त करते हैं. लाइनों है कि विकासशील photoreceptors में व्यक्त करते हैं Gal4 - जीएमआर (सभी photoreceptors) Gal4 8 और (R4 और R7 के विकास) mDelta0.5 - Gal4 13 शामिल हैं. कई विशिष्ट Gal4-subtype ड्राइवर लाइनों उपयोग करें कि अलग Rhodopsin 14 प्रमोटरों मौजूद हैं. रहते इमेजिंग में विशेष रूप से उपयोगी फ्लोरोसेंट जांच photoconvertible प्रोटीन होते हैं. हम सफलतापूर्वक Dendra2, एक monomeric हरी लाल photoconvertable 15 प्रोटीन का इस्तेमाल किया है. ध्यान दें कि Dendra2 के लिए photoconvertible 488nm आर्गन लेजर पंक्ति का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. हालांकि, हम करने के लिए रूपांतरण प्राप्त करने के लिए दिखाई नीले प्रकाश या तो पारंपरिक या गुंजयमान confocal स्कैनिंग मोड में हमारे सेट अप का उपयोग कर का उपयोग करने में असमर्थ हैं. इसके विपरीत, 405nm यूवी लेजर के साथ रूपांतरण कुशल है.
3. Immunohistochemistry:
तय वयस्क आँख के लिए, हम अक्सर या तो rhodamine phalloidin (Invitrogen, Inc,) या विरोधी Chaoptin (एक फोटोरिसेप्टर विशिष्ट एंटीबॉडी 16) का चयन करने के लिए rhabdomeric संरचना (चित्र 1A) कल्पना. लामिना कारतूस संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक अच्छा तरीका करने के लिए 16 विरोधी chaoptin, glial मार्कर 17 विरोधी आबनूस, और 18 विरोधी sec6 (चित्र 1 बी ) गठबंधन है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 3, एंटीबॉडी के इस संयोजन के प्रमुख (chaoptin) presynaptic और postsynaptic (sec6) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 19 लामिना में उपकला glia आबनूस () अलग प्रक्रियाओं .
कोडांतरण छिड़काव चैंबर
रहते इमेजिंग के लिए, हम है कि ऊतक तैयारी के बिना परेशान समाधान की धीमी गति से आदान - प्रदान की अनुमति देता है एक छिड़काव कक्ष को रोजगार. छिड़काव चैम्बर विधानसभा के एक प्रदर्शन वीडियो में शामिल है और schematically चित्रा 2 में दिखाया गया है. छिड़काव चैम्बर के विधानसभा छवि में सचित्र है. 2A. नमूना से अधिक गैसकेट पहले बिछाने से शुरू, और फिर विधानसभा के साथ जारी रखने के रूप में दिखाया गया है. पाल बांधने की रस्सी के प्रयोजन के आधार और चैम्बर के ढक्कन, एक स्थान है जो अंदर ऊतक और सील है जिसके माध्यम से समाधान बहेगा के बीच एक जगह बनाने के लिए है. गैस्केट के अंदर जगह (समाधान यहाँ प्रवेश करती है) इनलेट, ऊतक प्रस्तुत करने का, और दुकान के माध्यम से जो समाधान कक्ष पत्ते शामिल करना चाहिए. पाल बांधने की रस्सी के दो सुविधाओं के महत्वपूर्ण हैं: पहले, मस्तिष्क के लिए काफी मोटी गैसकेट अभी तक काफी पतली है एक उच्च संकल्प के साथ लेंस इमेजिंग की अनुमति चाहिए. आदर्श गैसकेट मोटाई सेट अप विशिष्ट मानकों पर निर्भर करता है. दूसरा, गैस्केट में एक पायदान एक कम्पार्टमेंट है कि नमूना (चित्र 2B) से संपर्क के बिना एक बुलबुले के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है.
माइक्रोस्कोप में इमेजिंग
हम छिड़काव या किसी स्लाइड पर मध्यम संस्कृति में सीधे एक 63x पानी विसर्जन लेंस कक्ष के लिए एक 63x (1.3 एपर्चर) ग्लिसरीन विसर्जन लेंस का उपयोग करें. ग्लिसरीन लेंस तेल लेंस से अधिक काम दूरी प्रदान करते हैं. हम एक गुंजयमान स्कैनिंग confocal खुर्दबीन जो एक पारंपरिक स्कैनर (8000 हर्ट्ज बनाम 1400 हर्ट्ज, क्रमशः) की तुलना में बहुत तेजी से दरों पर स्कैन का उपयोग करें. गूंजनेवाला स्कैनिंग समय के साथ तेजी से 3 आयामी रिकॉर्डिंग की अनुमति देता हैएर फ्रेम दरों. इसके अलावा, तेजी से स्कैन की गति काफी कम लेजर 6 phototoxicity जो जीवित ऊतक के दोहराया स्कैन के लिए एक प्रमुख चिंता का विषय है . लेजर की तीव्रता और PMT वोल्टेज (लाभ) का एक संतुलन के लिए संकेत को अधिकतम जबकि कम से कम शोर और photobleaching हासिल किया जाना चाहिए. एक महत्वपूर्ण आगे विचार है कि किसी दिए गए क्षेत्र पर लेजर प्रभाव की राशि संकल्प और ज़ूम के द्वारा निर्धारित किया जाता है. उदाहरण के लिए, पसंद का एक क्षेत्र 512x512, 1x ज़ूम के रूप में एक ही संकल्प 256x256, ज़ूम 2x पर स्कैन है, अभी तक ज़्यादा से ज़्यादा संभव रहते इमेजिंग गति 256x256 में 4 गुना तेजी से है, 2x ज़ूम. जल्दी से intracellular डिब्बों बढ़ने की गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, हम सफलतापूर्वक निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ दर्ज की गई है: एक की दर पर z ढेर 5 प्रति तख्ते 8000 हर्ट्ज और 2x लाइन औसतन एक स्कैन गति के साथ प्रति 10 सेकंड Z-ढेर. घंटे के पैमाने पर लंबे इमेजिंग सत्र के लिए, हम अक्सर कई मिनट प्रति फ्रेम दर को कम और बड़े क्षेत्रों का चयन के रूप में तैयारी और अधिक के लिए बदलाव की संभावना है.
ड्रोसोफिला दृश्य प्रणाली की शारीरिक रचना
चित्रा 3 ड्रोसोफिला वयस्क आंख (छवि 3A), वयस्क मस्तिष्क (3B छवि), और 20% -25% pupal आँख / डिस्क मस्तिष्क जटिल (छवि -3 सी) के शरीर रचना विज्ञान से पता चलता है. चित्रा 3A दोनों के साथ और लामिना और वसा जुड़ी कोशिकाओं के बिना वयस्क आंख दिखाता है. वयस्क आँख विच्छेदन के दौरान, लामिना, जो फोटोरिसेप्टर सेल निकायों (बाएं) द्वारा गठित एक कटोरी में बसे आँख के केंद्र में है, के नीचे (सही) सेल निकायों में बाधा पहुँचा के बिना हटा दिया जाना चाहिए. वयस्क मस्तिष्क विच्छेदन के लिए, एक फोटोरिसेप्टर सेल निकायों, लामिना, ऑप्टिक पालि, केंद्रीय मस्तिष्क, और ट्रेकिआ (छवि 3B) का भेद करने में सक्षम होना चाहिए. photoreceptors और ट्रेकिआ इस विच्छेदन के लिए हटा दिया जाना चाहिए जबकि ऑप्टिक पालि से जुड़ी लामिना छोड़ने. 20-25% pupal आँख जटिल / डिस्क मस्तिष्क की पहचान में सहायता करने के लिए, एक जीवित छवि चित्रा 3C में प्रस्तुत किया है.
चित्रा 1 (ए) वयस्क मस्तिष्क. (बी) वयस्क आँख. (सी) 20% -25% pupal eye-disc/brain जटिल.
चित्रा 2 (ए) परफ्यूज़न चैम्बर विधानसभा और (बी) गैसकेट नमूना करने के लिए सापेक्ष स्थिति.
चित्रा 3 (ए) वयस्क rhabdomere विरोधी chaoptin का उपयोग धुंधला हो जाना. (बी) वयस्क लामिना (हरे, photoreceptors) विरोधी chaoptin, विरोधी आबनूस (लाल, glia), और sec6 (नीले, interneurons) का उपयोग कर धुंधला हो जाना.
Acknowledgments
यह काम वेल्श (मैं 1657) फाउंडेशन और NIH (RO1EY18884) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. PRH जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक यूजीन McDermott विद्वान है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | |
| GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | |
| 20-Hydroxyecdysone | Sigma-Aldrich | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment:
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References
- Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
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