Summary
Este protocolo descreve três
Abstract
O
Protocol
1. Introdução
Neste vídeo, vamos demonstrar como preparar o cérebro e retina de Drosophila imagens ao vivo e imuno-histoquímica com foco em células fotorreceptoras. Primeiro, vamos mostrar como se preparar para dissecções cérebro. Em seguida, vamos demonstrar duas dissecções básicos comumente usado para imuno-histoquímica que formam a base para a preparação ao vivo. Estas duas preparações são o cérebro adulto e dissecções olho. Em seguida, vamos demonstrar a dissecções utilizado para geração de imagens ao vivo do cérebro adulto e em desenvolvimento, com ênfase na sua utilização para geração de imagens ao vivo de fotorreceptores. Finalmente, vamos descrever como nos tecidos imagem ao vivo e mostrar alguns exemplos de imagens ao vivo através de microscopia confocal de ressonância.
2. Preparação dissecção
- Para dissecções bom, você precisa de uma pinça afiada. Usando um bloco de nitidez ou de papel de areia muito fina (> 1500), gentilmente passar o fórceps frente e para trás em cada lado até o fim do mês em um ponto bom. Usamos um padrão de pedra de afiar. Não iremos cobrir a técnica de sharpening aqui, mas note que uma pinça afiada são essenciais para dissecções ao vivo. Afiamos fórceps antes de cada dissecção.
- Para dissecções cérebro adulto, coloque as moscas sobre uma almofada de CO 2 para anestesiá-lo e resolver o genótipo desejado. Para dissecções pupal, simplesmente chegar no frasco e remova cuidadosamente uma pupa com sua pinça, tomando cuidado para evitar quebrar o caso de pupa.
- Umedeça um Kimwipe com água. Você vai usar isso durante a dissecção para remover detritos do seu fórceps. Posição de um prato de dissecação no palco de um estereoscópio e preenchê-lo com HL3 solução 1. Todos dissecações será realizado em HL3 para garantir que o tecido permanece vivo e saudável durante o processo de dissecção. Além disso, usamos um prato dissecção que tem uma cobertura inferior da Sylgard para proteger forceps durante a dissecção.
- Agora, prepare fixação solução, se você pretende executar imuno-histoquímica. 180μL lugar de HL3 em um tubo de microcentrífuga 500μL. Adicionar 20μL de formaldeído 37% para obter uma solução de formol a 3,7%.
- Finalmente, a posição da mão adequada é importante para dissecções bom. Com a posição boa mão, o fórceps será estável e capaz de controlada, movimentos sutis. Primeiro, coloque a pinça do lado do seu polegar. Em seguida, coloque o dedo indicador para baixo de tal modo que a ponta do dedo repousa no topo. Agora descansar ao lado da pinça do lado do seu dedo médio e passar para o prato dissecção. Fazer contato físico com o prato pelo seu polegar eo dedo médio. Enquanto descansava o polegar eo dedo médio no prato, planta o seu pulso no palco microscópio. Desta forma, você tem três pontos firmemente plantados nas superfícies durante a dissecção e agora é possível fazer manipulações muito sutil do fórceps. Esta técnica pode sentir um pouco estranho no início, mas com a prática, em breve você vai ser um mestre de dissecções cérebro.
3. Cérebro adulto
- No bloco de CO 2, orientar adultos uma mosca lado ventral com a cabeça longe de sua mão. Agarre o tórax logo abaixo da cabeça. Se feito corretamente, as pernas e se estenderá tromba. Durante a visualização sob um estereoscópio, pegue a tromba estendida com o fórceps para remover a cabeça. Descartar o corpo e submergir a cabeça. Reorientar sobre a cabeça submersa. A dissecção inteira será realizada sob solução. É muito importante para prender a cabeça com uma pinça em todos os momentos. Caso contrário, a cabeça irá flutuar e é difícil de recuperar. Se a cabeça se move fora de foco durante a dissecção, simplesmente movê-lo de volta para o plano focal sem ajustar o microscópio. Esta tarefa aparentemente simples pode ser difícil no início, mas mantendo sua cabeça em foco se tornará mais fácil ao longo do tempo.
- Comece a dissecção pela primeira rasgar o tecido conjuntivo entre a tromba e os olhos. Lágrima no olho, mantendo firmemente com pelo menos um fórceps em todos os momentos. Esteja certo de que o dedo do fórceps está apenas abaixo da retina ou cutícula, para evitar danos no cérebro por baixo. Alternando direita e esquerda, use a sua pinça para arrancar a retina, trabalhando em direção a parte de trás da cabeça. Rasgar a retina vai aumentar as chances de que a lâmina permanece ligado ao lobo óptica ao longo deste dissecção. Continue em torno da parte traseira da cabeça, rasgando cutícula ao longo do caminho. Rasgam o outro olho e começar a se afastar cutícula. Enquanto você está pegando cutícula, você sabe que não está esmagando o cérebro! Com isto em mente, continue a puxar cutícula e retina afastado até que o cérebro é revelado.
- Uma vez que o cérebro é visível, você pode começar a remover traquéia anexado para o cérebro (Fig. 1A). Continuar a puxar a traqueia e cutícula até o cérebro está isolado. Neste ponto, você deve redirecionar para o fundo do seu prato para tele restantes passos. Remover a traquéia restante porque seu cérebro pode flutuar de outra forma durante a lavagem de anticorpos durante a noite. Para geração de imagens de terminais fotorreceptoras, é desejável manter a lâmina, mas você precisa remover a retina, que contém os corpos celulares e pigmentos fortemente autofluorescent. Para fazer isso, puxe cuidadosamente os restos espessa e pigmentada celular sem danificar a lâmina. Esta é uma habilidade fina e requer prática.
- O cérebro adulto pode ser mantido vivo por horas ou mesmo dias, utilizando as condições que vamos discutir na seção 6. Por imunohistoquímica, o cérebro adulto está pronto para ser fixado em formol. 2 Use um pipetteman P20 definido para 5μL para mover o cérebro adulto para a solução de fixação que você já preparado. Continue dissecar cérebros adultos por 20 minutos, o que deve render 10/04 cérebros. Deixe o cérebro em correção para um adicional de 40 minutos, no entanto, este tempo pode variar para a coloração ideal de anticorpos primários. Remover a solução de formaldeído e lavar os cérebros 3 vezes por 5 minutos cada, em 400μL de uma solução contendo PBS e 0,4% tritonX-100, a seguir denominada PBS-Triton. Depois de completamente de lavar a solução correção, você pode adicionar solução anticorpo primário.
4. Olho adulto
- Comece esta dissecção, como descrito para o cérebro adulto. Depois de submergir a cabeça e reorientar o microscópio, comece por rasgar o tecido conjuntivo entre a tromba e os olhos. Acima da tromba, separe a cutícula do olho. Agora, separado da cutícula da face inferior do olho, trabalhando em direção a parte de trás da cabeça. Com uma pinça, pegue o centro da parte traseira da cabeça. Com o outro, agarrar o olho e puxe. Permitir que o olho a se depositar no fundo do prato (Figura 1B). A lâmina provavelmente ainda ser anexados ao olho e pode ser usado para geração de imagens ao vivo dos terminais das células fotorreceptoras completamente intacto neste momento. Para continuar com imagens ao vivo de corpos celulares de fotorreceptores, vá para a seção 4.5. As próximas três seções explicam imunohistoquímica olho fixo.
- Por imunohistoquímica, mover o olho para fixação usando uma solução pipetteman P20 definido para 5μL. Continue dissecar os olhos de adulto para um total de 10 minutos. Deixar os olhos em correção para um adicional de 30 minutos. Remover a solução e corrigir conduta lavagens, como descrito na dissecção cérebro adulto.
- Se você deseja, em última análise a imagem da estrutura do olho ommatidial a lâmina deve ser removido agora. Devolver o olhar fixo para o seu prato dissecar e remover todas as células de gordura traquéia ou que ainda possam estar anexados. Em seguida, mantendo a parte externa do olho com uma pinça, retire a lâmina com o outro. Deve sair em uma única peça, expondo a cellbodies por baixo (Figura 1B). Tenha o cuidado de pegar a lâmina só! Caso contrário, corre o risco de separar os fotorreceptores da retina.
- Usando um pipetteman P20, mover os olhos para 400uL PBS-Triton em um tubo de 500uL. Suavemente de rock-los a 4 graus durante a noite para remover o pigmento vermelho do autofluorescent fotorreceptores. No dia seguinte, você pode descartar a solução de lavagem e adicione a solução de anticorpo primário.
- Para geração de imagens ao vivo de olhos adultos só usamos moscas adultas pharate, ou seja, pupas fase tardia pouco antes de eclosão. Nesta fase, os corpos fotorreceptoras cela separada dos terminais na lâmina durante a dissecção.
- Adulto Pharate pupas têm bem definidas as asas, olhos, e cutícula visível através do caso de pupa. Selecione uma pupa e remover a porção anterior do caso pupal para expor a região da cabeça. Remova cuidadosamente a fina membrana interna que, adicionalmente, encerra a voar em desenvolvimento. Agarre a base da cabeça com o fórceps e puxar. Descartar o resto da pupa, mantendo a cabeça submersa.
- Proceda como demonstrado na dissecção olho para imuno-histoquímica. Na fase adulta pharate, no entanto, os corpos de células fotorreceptoras irá separar mais facilmente a partir da lâmina, permitindo-lhe a imagem do corpo celular situado na retina. Além disso, a lâmina permanece ligado ao lobo óptico, permitindo-lhe a imagem da lâmina distal. Se você deseja a imagem da lâmina proximal, onde o terminal cartuchos de fotorreceptores pode ser visto, em seguida, executar a dissecção olho em uma mosca adulta, onde a lâmina é mais fortemente ligados aos olhos.
5. Desenvolvimento olho disco cérebro complexos
- O disco olho em desenvolvimento em 20% o desenvolvimento pupal (P +20%) tornou-se um favorito para imagens ao vivo em nosso laboratório, porque esta única camada de células relativamente grandes em desenvolvimento é facilmente observáveis através de microscopia confocal. 3
- Para selecionar uma pupa de 20%, olhar para os túbulos de Malpighi, um ponto verde aparece abaixo do caso de pupa, pupa e evitar que um "corpo negro" 4. Depois de selecionar um submergir P +20% pupa, em HL3 em seu prato de dissecação e remova cuidadosamente uma porção anterior do saco pupal, tendo o cuidadopara não penetrar na fina membrana interna. Segure a membrana interna com o fórceps e separar.
- Cuidadosamente visualizar o conteúdo liberado para encontrar o cérebro em desenvolvimento e os discos dos olhos que são bastante proeminentes (Fig. 1C). O olho complexo disco-cérebro é facilmente separados nesta fase de metamorfose. Isolar o cérebro no fundo do prato de dissecação. Separe cuidadosamente o cérebro central do lóbulo óptico. O disco lobo / olho óptica será utilizada na geração de imagens ao vivo.
6. Ao vivo Imaging: No microscópio
- Se desejar imagem por um curto período de tempo em apenas uma ou duas soluções, pode ser a imagem do seu tecido sobre uma lâmina de vidro. Neste caso, prepare o slide pela primeira camada na superfície com Sylgard usando as instruções do fabricante. Colocar 20μL HL3 no meio do slide. Transporte seu tecido dissecado em 20 mL adicional de HL3 ao slide. O tecido NUNCA deve ser exposto ao ar. Além disso, qualquer estresse ou tensão do manuseamento da pipeta ou tensão superficial solução deve ser evitado.
- Para geração de imagens ao vivo, o tecido deve ser fixado firmemente com manipulação mínima e entre em contato. Nós firmemente a posição do cérebro usando a água-polimerização GluShield cola cirúrgica aplicada através de um microeletrodo, uma técnica de rotina usado em preparações embrionárias para eletrofisiologia 5. Obter um eletrodo de vidro como os puxou para gravações eletrofisiológicas. Quebrar a ponta e preencha com o fim GluShield usando pressão negativa gerada pela boca. Quebrar apenas o suficiente do eletrodo, que cola pode entrar. Agora uso de pressão positiva para aplicar uma pequena quantidade de cola para a Sylgard sob uma gota de HL3. Agora, definir rapidamente o tecido sobre a cola, mantendo a orientação desejada para a imagem ao vivo. Uma lente de imersão em água agora pode ser usado para geração de imagens. Se você quiser adicionar um corante membrana permeável, você pode adicioná-lo ao banho enquanto imagem.
- Nós usamos um microscópio de varredura confocal Resonant que permite que imagens rápido com 6 fotobranqueamento reduzida. Para imagens durante longos períodos de tempo ou para soluções de câmbio totalmente ou várias vezes, usamos uma câmara de perfusão (Harvard IC30 confocal de imagem da câmara) que se conecta a uma bomba peristáltica que lentamente perfunde solução de cultura sobre o tecido vivo (Fig. 2A). Movimento de câmbio líquida constante e contato GluShield mínima reduzir o achatamento do tecido que tem sido observada ao longo de longos períodos de tempo 7. Note-se que para a imagem de períodos de tempo de desenvolvimento, o olho complexo disco-cérebro precisa permanecer intactos e deve ter o mínimo de contato com a cola.
- Use uma lamínula revestido com uma gota de Sylgard que é raspada para torná-lo fino e liso. Dispensar 20μL HL3 para o centro da lamela e cola o tecido vivo para o Sylgard. Gerar uma junta que permitirá que as bolhas para passar através da câmara, sem expor o tecido ao vivo para o ar (Fig. 2B). A junta deve ser grossa o suficiente para evitar o esmagamento do tecido, mas fina o suficiente para trazer o tecido perto da lente do microscópio confocal; usamos 250μm em nossa instalação. Montar a câmara de perfusão, tomando cuidado para manter o tecido completamente submerso o tempo todo. Comece a perfusão inicialmente a uma taxa próxima 100μL por minuto usando uma bomba peristáltica. Esta velocidade é bastante rápido, dependendo da espessura da junta que define a altura da câmara. Para imagens na escala de horas, você pode precisar adicionar 20-hidroxiecdisona e antibióticos, mas não antifúngicos, e realizar a perfusão em velocidades muito mais baixas em torno de 10μl por minuto. Finalmente, o oxigênio da bolha que no meio de cultura que abastece a câmara de perfusão.
7. Resultados representativos:
No final do nosso protocolo de vídeo mostramos um exemplo para geração de imagens ao vivo em células fotorreceptoras desenvolvimento, utilizando a preparação apresentados na Seção 5. Esta preparação leva vantagem de Drosophila transgênese para a célula, especificamente expressar repórteres fluorescentes. No exemplo mostrado, dois repórteres fluorescentes são expressos sob o controle do fotorreceptor driver específico GMR-Gal4 8: a membrana marcadas myrRFP eo marcador endossomal 2xFYVE-GFP 9. Conjuntos de dados de dois canais em 3D com uma caixa delimitadora de 70x70x17.5μm e um tamanho de voxel de 137x137x700nm (512x512x26) foram obtidos a cada 1 min. O filme mostra um plano selecionado ao longo do tempo neste conjunto de dados 4D que revela a dinâmica do tráfico intracelular endossomal e eventos fusão das vesículas. Imagens representativas para a preparação do tecido fixo do olho e lâmina são mostrados na fig. 3.
Discussion
Sondas fluorescentes usadas para criação de imagens
Aqui nós descrevemos os pontos fortes e limitações da preparação do sistema Drosophila visual para uma seleção de sondas fluorescentes a partir de três classes: (1) Sondas que são adicionados a uma preparação tecido vivo exogenamente; (2) proteínas fluorescentes que são geneticamente codificados para os dois ao vivo e imagens fixas (3); corantes fluorescentes que são adicionadas ao tecido fixo para imuno-histoquímica.
1. Sondas exógenos:
Lyso Tracker Verde DND-26 ou Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Estes são disponíveis comercialmente fluorescentes membrana permeável compostos que se acumulam em compartimentos fortemente acidificada na célula, o mais proeminente lisossomos, endossomos tarde, e autofagossomas. Lyso Tracker em concentrações nanomolar (que normalmente usam 50 nM) penetra na L3 e P disco olho +20% totalmente em menos de um minuto. Desde Lyso Tracker continuamente acumula e exerce um efeito alcalinizante, que imagem em menos de 5 minutos. Em contraste com os discos de olho, Lyso Tracker não penetra o cérebro sem rompimento do tecido. No entanto, cuidado rasgar da membrana externa permite a penetração de uma célula de alguns diâmetros no lóbulo óptico.
Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) Em contraste com Lyso Tracker, Lysosensor não se acumula em compartimentos acidificados, mas apresenta aumento de fluorescência em pH ácido. Lysosensor tem características de penetração que são muito semelhantes aos Lyso Tracker. Usamos Lysosensor a uma concentração de 1 Hm.
2. Sondas geneticamente codificado:
Para muitos experimentos com imagens ao vivo, nós expressamos genes marcados com várias moléculas fluorescentes como GFP, TagRFP 10 ou o pHluorin pH-sensíveis 11 sob o controle do sistema binário expressão Gal4/UAS 12. Gal4 linhas que expressam em fotorreceptores em desenvolvimento incluem GMR-Gal4 (todos os fotorreceptores) 8 e mDelta0.5-Gal4 (desenvolvimento R4 e R7) 13. Vários subtipo específico Gal4 driver-linhas existem que usam diferentes promotores rodopsina 14. Particularmente útil sondas fluorescentes em imagens ao vivo são proteínas photoconvertible. Temos utilizado com sucesso Dendra2, uma proteína verde-vermelho monomérica photoconvertable 15. Note-se que Dendra2 é projetado para ser photoconvertible usando uma linha de 488nm Argon laser. No entanto, somos incapazes de alcançar a conversão usando a luz azul visível através do nosso set-up no modo de varredura ou confocal convencional ou ressonante. Em contraste, a conversão com laser de 405nm UV é eficiente.
3. Imuno-histoquímica:
Para o olho adulto fixo, que muitas vezes escolher rodamina phalloidin (Invitrogen, Inc.) ou anti-Chaoptin (um anticorpo específico fotorreceptoras 16) para visualizar a estrutura rhabdomeric (Fig 1A). Uma boa maneira de analisar a estrutura do cartucho de lâmina é combinar anti-chaoptin 16, o marcador glial anti ébano-17 e anti-sec6 18 (Fig. 1B). Como mostrado na figura. 3, esta combinação de anticorpos distingue os principais pré-sináptico (chaoptin) e pós-sináptico (sec6) processos, bem como glia epiteliais (ebony) na lâmina 19.
Montagem da Câmara de Perfusão
Para geração de imagens ao vivo, nós empregamos uma câmara de perfusão que permite a troca lenta de soluções sem atrapalhar a preparação do tecido. Uma demonstração de reunião de câmara de perfusão está incluído no vídeo e esquematicamente mostrado na Figura 2. Assembleia da câmara de perfusão é ilustrada na Figura. 2A. Comece colocando a junta sobre a primeira amostra, e então continuar com a montagem como mostrado. A finalidade da junta é criar um espaço entre a base da câmara ea tampa, um espaço dentro do qual o tecido é selado e através do qual a solução de fluxo. O espaço dentro da junta deve incluir a entrada (solução entra aqui), a preparação do tecido, e na tomada através do qual a solução deixa a câmara. Duas características da junta são fundamentais: primeiro, a junta deve ser grossa o suficiente para o cérebro ainda fina o suficiente para permitir que imagens com uma lente de alta resolução. A espessura da junta ideal depende de set-up parâmetros específicos. Segundo, um entalhe no junta fornece um compartimento que permite que uma bolha para passar sem entrar em contato com a amostra (Fig 2B).
Imagens ao microscópio
Nós usamos um 63x (abertura 1.3) lente de imersão de glicerina para a câmara de perfusão ou uma lente de imersão 63x de água diretamente no meio de cultura em um slide. As lentes de glicerina fornecer mais trabalho à distância que as lentes de petróleo. Nós usamos um microscópio de varredura confocal ressonante que verifica a taxas muito mais rápido do que um scanner convencional (8000 Hz 1400 Hz em relação, respectivamente). Digitalização de ressonância permite 3-dimensional gravações ao longo do tempo em fastquadro de taxas de er. Além disso, maiores velocidades de varredura a laser reduzem significativamente fototoxicidade 6, que é uma grande preocupação para as verificações repetidas de tecido vivo. Um balanço da intensidade do laser e tensão PMT (ganho) deve ser alcançada para maximizar o sinal, minimizando o ruído e fotodegradação. Uma consideração importante ainda é que a quantidade de impacto laser em uma determinada região é determinada por resolução e zoom. Por exemplo, uma região de escolha é digitalizado com a mesma resolução de 256x256, zoom de 2x como em 512x512, zoom de 1x, mas a velocidade máxima de imagem possível viver é 4 vezes mais rápida, 256x256, zoom de 2x. Para registrar a atividade de rapidamente mover compartimentos intracelulares, conseguimos gravado com as seguintes configurações: 5 quadros por z-stack a uma taxa de um z-stack por 10 segundos com uma velocidade de digitalização de 8000 Hz e uma média de linha de 2x. Para as sessões de imagem muito sobre a escala de horas, muitas vezes reduzir a taxa de quadros para um por vários minutos e escolher áreas maiores como a preparação é mais provável a mudar.
Drosophila Anatomy Sistema Visual
A Figura 3 mostra a anatomia do olho adulto Drosophila (Fig. 3A), o cérebro adulto (Fig. 3B), e os 20% -25% pupal olho complexo disco / cérebro (Fig. 3C). Figura 3A ilustra o olho adultos com e sem a lâmina e células de gordura em anexo. Durante a dissecção dos olhos de adultos, a lâmina, que está no centro do olho situado em uma bacia formada pelos corpos celulares fotorreceptor (esquerda), deve ser removido sem perturbar os corpos celulares por baixo (à direita). Para a dissecção do cérebro adulto, a pessoa deve ser capaz de distinguir os corpos celulares fotorreceptor, a lâmina, o lobo óptico, o cérebro central, e traquéia (Fig. 3B). Os fotorreceptores e traquéia precisam ser removidos para esta dissecção, deixando a lâmina anexado ao lobo óptico. Para ajudar na identificação do complexo olho pupal 20-25% do disco / cérebro, uma imagem ao vivo é apresentado na Figura 3C.
Figura 1. (A) cérebro adulto. (B) dos olhos dos adultos. (C) 20% -25% pupal complexo eye-disc/brain.
Figura 2. (A) de montagem da câmara de perfusão e (B) posicionamento da junta relativa à amostra.
Figura 3. (A) coloração Adulto rhabdomere usando anti-chaoptin. (B) a coloração da lâmina de adultos usando anti-chaoptin (verde, fotorreceptores), anti-ébano (vermelho, glia), e sec6 (azul, interneurônios).
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Welch (I-1657) e os NIH (RO1EY18884). PRH é um Eugene McDermott Scholar em Investigação Biomédica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 103251252 | |
| GluShield | GluStitch, Inc. | GB055QO | |
| 20-Hydroxyecdysone | Sigma-Aldrich | H5142-10mg | 5mg/ml in EtOH |
Special Equipment:
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References
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