En la zona subventricular cara: tinción wholemount y flujo ependimarios

Summary

Las paredes del ventrículo lateral se encuentra la mayor región germinales en el cerebro adulto de mamíferos. Tradicionalmente, los estudios sobre la neurogénesis en esta región se han basado en las técnicas clásicas de corte para el análisis histológico. Aquí se presenta un enfoque alternativo, la técnica wholemount, que ofrece una completa, en la cara vista de esta región germinal.

Abstract

Las paredes de los ventrículos laterales contienen la mayor región germinales en el cerebro adulto de mamíferos. La zona subventricular (SVZ) en estos muros es un sistema modelo estudiado para comprender el comportamiento de las células madre neurales y la regulación de la neurogénesis adulta. Tradicionalmente, estos estudios se han basado en las técnicas clásicas de corte para el análisis histológico. Aquí se presenta un enfoque alternativo, la técnica wholemount, que ofrece una completa, en la cara vista de esta región germinal. En comparación con las secciones, wholemounts preservar la citoarquitectura completa y las relaciones celulares dentro de la SVZ. Este enfoque ha revelado recientemente que las células madre neurales adultas o células de tipo B1, son parte de un neuroepitelio se mezcla con las células diferenciadas ependimarias revestimiento de los ventrículos laterales. Además, este enfoque ha sido utilizado para estudiar la polarización plana de células ependimarias y el flujo del líquido cefalorraquídeo que generan en el ventrículo. Con la evidencia reciente de que células madre neurales adultas son una población heterogénea que se especifica regional, el enfoque wholemount probablemente será una herramienta esencial para la comprensión de la organización y la parcelación de este nicho de células madre.

Protocol

I. Preparación de Micropipetas de vidrio lleno de microesferas fluorescentes para ensayo de flujo ependimarios (estos pasos puede ser evitado si la preparación de wholemounts para fines de tinción solamente).

1. Asegurar un tubo de vidrio Wiretrol 5 ul capilar en vidrio micropipeta extractor y ajustar la configuración del calentador y la bobina para sacar la pipeta con un cono suave y superficial.
2. Conecte una fuente de presión positiva de aire en el extremo de la micropipeta tira y baje suavemente la punta de la pipeta en una superficie de rejilla metálica en un ángulo de 45 ° para crear una punta biselada. Presión de aire positiva ayuda a limpiar los residuos de vidrio desde el interior de la pipeta. Limpie el extremo de la punta biselada con una mezcla de etanol-húmedo del tejido.
3. Examine la punta de la pipeta con un microscopio con un micrómetro. La punta debe tener un bisel liso con un diámetro de apertura interna de aproximadamente 100 um. Diámetros más pequeños se pueden utilizar pero a menudo resultan en la obstrucción de la pipeta con perlas fluorescentes.
4. Relleno pipeta con aceite mineral hasta mediados, a continuación, inserte la grasa por inmersión en el émbolo de la pipeta en la espalda. Avance del menisco de aceite mineral a la punta de la pipeta de forma manual presionando en el émbolo.
5. Asegurar la micropipeta y el émbolo en un micromanipulador, vuelva a atornillar el soporte de pipeta micromanipulador en un pequeño brazo fijo con altura regulable.
6. De carga frontal de la pipeta con la solución de microesferas fluorescentes, que consta de fluorescentes solución al 50% de valores microesferas, 45% de agua, y el 5% de glicerol. El glicerol es agregado para aumentar la densidad de la solución para que cuando se deposita en el wholemount las microesferas hundirse en la superficie.
7. Coloque el micromanipulador en un lugar seguro donde la aguja no se han roto accidentalmente y proceder a la disección wholemount.

II. La disección y fijación wholemount

1. Para prepararse para la disección wholemount, la cantidad suficiente de calentamiento L-15 los medios de comunicación Leibovitz a 37 ° C. Usted tendrá aproximadamente 10 ml por animal va a disecar. También se reúnen todos los suministros que necesitará para la disección y fijación por el microscopio estereoscópico: tijeras, pinzas de dientes grandes, lisas pinzas finas, Sharpoint 22,5 ° cuchillo microquirúrgico de arma blanca, placa de disección, una toalla de papel, bolsa de riesgo biológico, y una placa de 24 pocillos en el hielo llenas de paraformaldehído al 4% con o sin 0,1% Triton X-100. Triton X-100 se utiliza para disminuir la tensión superficial de la solución de PFA, lo que disminuye la incidencia de la esquila de la superficie wholemount cuando se sumerge en esta solución.
2. Vierta 5-10 ml de los medios de comunicación en un plato caliente de disección bajo un microscopio estereoscópico fluorescente. La disección de los platos son preparados mediante el vertido de un polímero elástico llamado Sylgard 184, en un plato de plástico de 6 cm y dejar que el cura solución de polímero durante 1 semana al vacío, y luego enjuagando los platos en grandes volúmenes de agua antes de su uso. Por lo general, dejamos los platos en remojo en agua en un vaso de 1 litro por 1 semana.
3. El animal es sacrificado por dislocación cervical y la cabeza es cortada.
   Nota: Si lo desea, la sangre se borren de la vasculatura de la perfusión del animal con solución salina normal antes de la disección de cerebro. Esto es particularmente importante si se realiza inmunotinción cromogénico con diaminobencidina (DAB).
4. Una incisión se hace, de atrás hacia delante, a lo largo del cuero cabelludo para revelar el cráneo.
5. Una serie de cuatro cortes en el cráneo son la apertura del cráneo: un corte se extiende por las dos órbitas por delante de los bulbos olfatorios, los próximos dos cortes son inferiores a los del cerebelo y separadas del cráneo de la base del cráneo, y se ejecuta el corte final de atrás hacia delante a lo largo de la sutura sagital.
6. Las solapas del cráneo son ligeramente retraído y el cerebro se extrae y se coloca en el plato de disección.
7. El resto de la disección se realiza bajo el microscopio estereoscópico. En primer lugar, los bulbos olfatorios se disecan lejos del cerebro. Si lo desea, además, para examinar los bulbos olfatorios, sólo tiene que arreglar por inmersión en el 4% PFA durante la noche y, posteriormente, puede prepararlos para el corte y coloración.
8. Divide el cerebro a lo largo de la cisura interhemisférica.
9. Un corte coronal orientado entonces se hace en la cara posterior, la mayor parte de la cisura interhemisférica, permitiendo que el caudal del hipocampo para ser visualizados en la sección transversal.
10. El hipocampo, que forma la pared medial del ventrículo lateral en esta posición, entonces deben ser liberados de la corteza que recubre, que forma la pared dorsal-lateral del ventrículo. En primer lugar, el cuchillo se inserta en el espacio ventricular pequeña entre la corteza y el hipocampo dorsal, y se hace una incisión en la corteza donde se refleja ventral, lejos de la línea media, para unirse al hipocampo. Después de este corte se hace, la corteza puede ser lentamente desprendido del hipocampo para revelar el ventrículo lateral pasando de dorsal a ventral. Esta maniobra esacelerada, cortando un trozo de corteza en la esquina de donde fue liberado el hipocampo. Después de alcanzar el punto más ventral del ventrículo lateral en esta posición, usted puede visualizar o sentir en la corteza de nuevo envuelve, lo que refleja esta vez de nuevo hacia dentro, para unirse al hipocampo. Otro corte se debe hacer en esta posición para liberar completamente el hipocampo o la pared medial del ventrículo lateral de la corteza o en la pared lateral del ventrículo lateral.
11. A continuación, será fácil de lograr en el hipocampo de distancia de la corteza, medial y anteriormente, para abrir el ventrículo lateral ampliamente.
12. Continúe tirando con suavidad hacia delante usando el hipocampo pequeñas pinceladas de las pinzas y un cuchillo para retirar de las paredes medial y lateral de distancia.
13. Una vez que la resistencia a esta retracción comienza a aumentar, los recortes adicionales son necesarios. En primer lugar, para aumentar su exposición a los ventrículos laterales y en particular, la pared lateral y SVZ, diseccionar la corteza. La corteza es limpia diseccionada mediante la visualización de la interfaz entre el cuerpo calloso y el VZ / SVZ. Simplemente corte a lo largo de esta interfaz permanecer en el lado del cuerpo calloso para evitar dañar la SVZ.
14. Con el fin de continuar retracción de la pared medial de la pared lateral, dos cortes más se necesitan: un corte dorsal en la pared lateral, la pared medial, corteza y todos convergen, y un corte en el vientre de la pared lateral, la pared medial y el tálamo convergen. Con estos cortes hechos, la retracción más suave en la pared medial permite la medida de lo anterior-la mayoría de los ventrículos laterales a ser abierto.
15. Una iluminación adecuada es esencial durante todo el procedimiento y, sobre todo en el siguiente paso en las paredes medial y lateral están separadas anteriormente. En esta posición anterior en el ventrículo lateral, la pared medial se refleja y se continua con la pared lateral. Ajuste la luz de tal manera que las sombras proyectadas entre las dos paredes revelar este punto de reflexión, que aparece como un valle entre las dos paredes. Corte exactamente en este valle que separa estos dos paredes.
16. Por último, exponer por completo la pared lateral, eliminando las que domina la corteza y el tálamo dorsal, la ventral.
17. Si la preparación de wholemounts de inmunotinción, transferir cuidadosamente el lado wholemount, hasta el ventrículo, desde el plato de la disección en una placa de 24 pozos llenos de PFA al 4% con o sin 0,1% Tritón-X100 de una fijación durante la noche a 4 ° C. Para la fijación de antígenos y minúsculas, wholemounts pueden ser fijos por períodos más cortos de tiempo. A continuación, proceder a la sección 4 de wholemounts inmunotinción.
18. Si la preparación para el análisis de flujo de wholemounts ependimarias, la transferencia de la wholemount a un plato de disección limpia llena de dulce, 37 ° C medio Leibovitz y pasar a la siguiente sección.

III. Análisis del flujo de microesferas fluorescentes con ependimarias

1. Inmovilizar el wholemount en un plato limpio con la disección de 2 pines de insectos, uno en el tálamo y el otro en antero-dorsal esquina de la wholemount.
2. Coloque la base del brazo fijo la celebración de la micromanipulador junto a la lupa binocular. Asegúrese de que la altura del brazo ajustable es la máxima elevación para evitar la rotura de la aguja contra el plato de la disección.
3. Cuidadosamente moje la punta de la aguja en los medios de comunicación en un tubo de ependorf para limpiar microesferas que se encuentran en el extremo exterior de la aguja. Si estos no se limpian de distancia, que posteriormente podrán ser depositados en la superficie wholemout inadvertidamente durante la aguja de posicionamiento y reducir la calidad general de la película.
4. La posición de la punta de la aguja sobre la superficie dorsal de la pared lateral y bajar el brazo para que la punta de la aguja en el medio. La aguja se debe reducir hasta que quede justo por encima de la superficie de la pared lateral.
5. Con la aguja en posición, ajustar el zoom y el enfoque en el microscopio estereoscópico para cubrir un campo que desee. Si va a realizar una grabación del flujo ependimarias, proceso de adquisición de imágenes en este momento.
6. Expulsar ~ 5 nl de la solución de microesferas sobre la superficie de la wholemount. Una vez que el bolo inicial de cuentas ha sido borrada de la superficie por el flujo de ependimarias, rondas adicionales de eyección del cordón se pueden realizar.

IV. Wholemounts inmunotinción

1. Wholemounts disecados para inmunotinción se inmersión fijos durante la noche en PFA al 4% con o sin 0,1% Tritón-X100 a 4 ° C. El uso de Triton-X100 es el preferido para los antígenos que tolerar este tratamiento, pero se puede dejar en los casos en que se disminuye la calidad de la tinción de detergente.
2. A la mañana siguiente, PFA se aspira de la placa de 24 pozos y la wholemounts se lavó 3 veces durante 5 minutos cada uno en PBS 0,1 M, con o sin 0,1% Tritón-X100. Como antes, el uso de Triton-X100 es preferible, pero no es obligatorio, para todos los lavados en el presente Protocolo. A lo largo de este protocolo, el intercambio de soluciones sobre la totalidadmontaje requiere una aspiración cuidadosa de la solución desde el lado del bien. Entonces, el pozo se rellena con una solución con una pipeta de transferencia en ángulo tal que la solución se lava sobre el borde del pozo, no directamente sobre la wholemount. Tenga cuidado de mantener el lado del ventrículo wholemount hacia arriba en todo momento. Pipeteo vigoroso de las soluciones a menudo le dará la vuelta al wholemount. Nosotros preferimos el intercambio de soluciones sobre una wholemount a la vez para evitar que los tejidos se sequen.
3. Después de lavar la PFA, wholemounts se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente en solución de bloqueo, que contiene 10% de suero normal de cabra o burro en PBS 0,1 M, con o sin Triton-X100. Si con el Tritón-X100 para su coloración, puede optar por utilizar el 2% o 0,5% Triton-X100 en la solución de bloqueo. Utilizamos 2% Triton-X100 cuando la tinción de antígenos que requieren una mayor penetración de anticuerpos en el tejido, como los antígenos localizados en la SVZ. Sin embargo, cuando la tinción de antígenos localizados cerca de la superficie de la pared lateral, como antígenos que se encuentran en la superficie apical de las células ependimarias, utilizamos 0,5% Triton-X100. Además, Triton-X100 se puede dejar fuera de la superficie celular u otros antígenos que se han eliminado o alterado por un detergente.
4. A continuación, retire la solución de bloqueo y añadir anticuerpos primarios diluidos en la misma solución de bloqueo y se incuba durante 24 o 48 horas a 4 ° C. Elección del período de incubación depende del antígeno, de forma similar a la elección de Triton 0.5% o 2%. De antígenos localizados en la superficie de la wholemount, 24 horas de incubación es suficiente. Sin embargo, para los antígenos localizados más profundo, como en la SVZ, 48 horas períodos de incubación de proporcionar mejores resultados.
   Por ejemplo, para estudiar la superficie apical y cuerpos basales de las células que recubren la pared del ventrículo lateral, se tiñen con anticuerpos frente a β-catenina, la etiqueta de la membrana celular, y γ-tubulina, para etiquetar los cuerpos basales. Diluir el ratón anti-β-catenina de anticuerpos (1:500) y el conejo anti-γ-tubulina anticuerpos (1:1000) en PBS 0,1 M que contiene 10% de suero normal de cabra y un 0,5% Triton-X100. Incubar a 4 ° C durante 24 horas.
   Para la tinción de las células madre neurales adultas o células de tipo B1, la mancha de la pared lateral con anticuerpos GFAP. Diluir el ratón anti-GFAP anticuerpos (1:500) en PBS 0,1 M que contiene 10% de suero normal de cabra y un 2% Triton-X100. Incubar a 4 ° C durante 48 horas.
5. Anticuerpos primarios se lavan inicialmente por 2 aclarados rápido en PBS con o sin 0,1% Tritón-X100. A continuación, realice tres lavados adicionales de 20 minutos cada una a temperatura ambiente.
6. Diluir anticuerpos secundarios en la misma solución utilizada para el bloqueo de anticuerpos primarios y añadir a wholemounts incubar durante el mismo período de tiempo como de anticuerpos primaria a 4 º C.
   Por ejemplo, para la tinción de β-catenina y la γ-tubulina: diluir Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón (1:400, reconoce el ratón anti-β-catenina) y Alexa Fluor 594 anticuerpos de cabra anti-conejo (1:400, reconoce conejo anti-γ-tubulina) en 0,1 M de PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y un 0,5% Triton-X100. Incubar a 4 ° C durante 24 horas.
   Para la inmunotinción GFAP: diluir Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón (1:400, reconoce el ratón anti-GFAP) en 0,1 M de PBS que contenía 10% de suero normal de cabra y un 2% Triton-X100. Incubar a 4 ° C durante 48 horas.
7. Anticuerpos secundarios se lavan las wholemount con los lavados mismo realizados para anticuerpos primarios.
8. Si lo desea, nuclear contra-tinción se puede realizar en este punto mediante la incubación de DAPI diluido en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lavar una vez en PBS.

V. Montaje Wholemounts Immunostained en portaobjetos para microscopía confocal

1. De alta resolución de imagen confocal, después de la tinción wholemounts necesarios para ser sub-disecados para conservar sólo la pared lateral del ventrículo lateral de una porción de tejido 200-300 um de espesor. La separación de la pared lateral del cuerpo estriado subyacente le permite ser montado en un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos de una manera plana.
2. Volver a la lupa binocular con wholemounts immunostained y las herramientas y equipos siguientes: suave pinzas finas, Sharpoint 22,5 ° cuchillo microquirúrgico de arma blanca, placa de disección, portaobjetos y cubreobjetos, PBS 0,1 M, y el medio Aquamount montaje.
3. Transferir el wholemount de la placa de 24 pozos para el plato de disección que contiene 0,1 M de PBS, teniendo cuidado de mantener el ventrículo lateral hacia arriba.
4. En primer lugar, eliminar completamente la corteza dorsal del wholemount de posterior a anterior, cortando con precisión a lo largo de la línea en el cuerpo calloso y la pared lateral. Esto se reconoce como la interfaz entre la materia del cuerpo calloso blanco y el rosa SVZ de apariencia.
5. A continuación, hacer un corte largo horizontal orientados a través de la cara ventral de la wholemount. Esta superficie de corte será una plataforma en la que puede stabilize la wholemount durante el siguiente paso en la disección.
6. Con la superficie dorsal de la wholemount hacia arriba, usted será capaz de visualizar el espesor de la SVZ de adelante hacia atrás a lo largo de la pared lateral. Tenga en cuenta que este punto de vista fue posible gracias a la extracción de la corteza cerebral permitiendo que el cuerpo estriado subyacente y SVZ está por verse. La SVZ es identificado como la banda delgada de tejido que se extiende desde la superficie ventricular en el cuerpo estriado. La SVZ tiene una apariencia homogénea de color rosa, mientras que el cuerpo estriado está infiltrada por los cables de la materia blanca. Tenga en cuenta que la SVZ es más gruesa por delante y se hace cada vez más delgado por detrás.
7. Una vez que haya identificado la interfaz de la SVZ y el cuerpo estriado, empezar a cortar con cuidado en esta interfaz en la cara anterior-la mayoría de la pared lateral, avanzando el cuchillo de dorsal a ventral. Para hacer esto con precisión, estabilizar la wholemount con fórceps utilizados como dos alfileres. También puede utilizar el fórceps para girar ligeramente la wholemount para visualizar la hoja de avance de dorsal a ventral a través de la pared lateral. La clave de esta disección de la cinta resultante del tejido a ser muy plana. Esto significa que a medida que parte de la SVZ de adelante hacia atrás a través de la pared lateral, la orientación de los cortes que hacer debe permanecer paralela a la superficie ventricular en todo momento.
8. Recuerde que más atrás, la SVZ se hace más delgada. En lugar de adelgazamiento de su disección de cortar sólo la SVZ en este punto, es importante que a medida que avance posterior, el espesor del tejido que se diseca sigue siendo el mismo. Esto asegurará que la porción de tejido que posteriormente se montará es plana.
9. Después de la separación completa de la pared lateral del cuerpo estriado subyacente, retire con cuidado todos los tejidos que rodean a esta franja que no forman parte de la pared ventricular.
10. Luego tomar esta franja de abajo con sus pinzas y colóquelo en el centro de un portaobjetos de microscopio. Aplique unas gotas de aquamount directamente sobre la wholemount y suavemente coloque un cubreobjetos centrado sobre esto, tratando de no introducir burbujas en la superficie del tejido. El peso de la diapositiva se asegurará de que se dispersa de manera uniforme y aquamount produce un aplanamiento de la superficie de refinado de la pared lateral. La cantidad de aquamount utilizados y el tamaño del cubreobjetos dependen de la edad del tejido que se está disecado. Para los tejidos embrionarios y postnatal temprano, preferimos una gota de aquamount y una de 22 "x 30" cubreobjetos. Más pesado cubreobjetos puede distorsionar el tejido y más aquamount va a interferir con la calidad de imagen debido a que el láser confocal será menos capaz de penetrar una capa delgada de aquamount que residen entre el cubreobjetos y la superficie del tejido. Para los tejidos más tarde postnatal y adulto, utilizamos cuatro gotas de aquamount y un 24 "x 60" cubreobjetos.
11. Las diapositivas se almacenan plana en un libro de diapositivas a 4 ° C durante 1-2 días antes de la imagen para permitir que el cubreobjetos a un acuerdo.

Resultados representante

Enfoques wholemount han dado varias ideas clave en la actividad germinal del adulto SVZ. La red de cadenas de la migración de las neuronas jóvenes en la SVZ fue observado por primera vez después de wholemounts de la pared lateral del ventrículo lateral se realizó la inmunotinción con anticuerpos frente a polysialylated molécula de adhesión celular neural (PSA-NCAM) ^1. Estas cadenas de neuroblastos emigran también se puede ver después de la inmunotinción con anticuerpos wholemounts doublecortin (Figura 1). Cabe destacar que la red de cadenas tiene un patrón estereotipado, con dos corrientes generales de las células, un funcionamiento más dorsal y ventral uno corriendo alrededor del punto de adherencia. Wholemounts de la SVZ también proporcionan una visión completa de la actividad proliferativa de los progenitores en esta región, como se observa en la tinción Ki67 en la Figura 2. Curiosamente, dos estudios recientes sugieren una estrecha interacción entre las células en división SVZ y la vasculatura local de ^2,3 (Figura 2).

Cuando se examinan bajo el microscopio confocal de alta potencia, el punto de vista en la cara siempre por wholemounts permite una perspectiva única de la superficie apical de las células que recubren el sistema ventricular. Esta perspectiva en la cara ha revelado recientemente que SVZ células de tipo B1, las células madre neurales adultas, son parte de un neuroepitelio se mezcla con la no división de las células diferenciadas ependimarias ^4. La superficie apical de las células de tipo B1 en contacto con el ventrículo lateral y está rodeado de grandes superficies apicales de las células ependimarias en una configuración de molinillo de viento (figura 3, las flechas indican las superficies B1 apical). Además, un examen minucioso de la superficie apical de las células ependimarias, ha revelado que la posición de traslación y orientación de rotación de sus cuerpos basales son indicadores de su polaridad plana ^5. Ependimarias de células basales bomuere se agrupan en un parche en la superficie apical. Este parche se desplaza desde el centro de la superficie apical en el río abajo ", orientación con respecto al flujo del LCR (polaridad de traslación), dentro de este parche, cada basal del cuerpo se gira sobre su eje longitudinal de tal manera que el pie basal, un accesorio de la basal cuerpo, apunta en la dirección del flujo (polaridad de rotación). vecinos células ependimarias tienen sus cuerpos basales orientado en la misma dirección. Es importante destacar que videomicrographs de la prueba de flujo ependimarias se puede utilizar para comparar directamente el flujo en una región específica de la pared lateral a la orientación de los cuerpos celulares ependimarias basal en la región (Figura 4).

Además de ofrecer una perspectiva panorámica de la región más grande germinales en el cerebro adulto, con imágenes de mayor potencia, wholemounts permitir un análisis más completo y detallado de las distintas morfologías celulares en la SVZ. Imágenes de alta potencia confocal de inmunotinción GFAP en wholemounts ha revelado que las células de tipo B1, además de su corta ventrículo-ponerse en contacto con el proceso apical, tienen un proceso basal mucho tiempo en contacto con los vasos sanguíneos (Figura 5) ^4. Esta citoarquitectura no había sido apreciada con anterioridad en las secciones coronal debido a que el proceso basal funciona sobre todo en paralelo a la pared ventricular. Seccionamiento de serie por lo tanto, los cortes células individuales en pequeños fragmentos, por lo que es casi imposible reconstruir la morfología completa de una célula s, o para entender su relación con otros tipos de células en la SVZ. El enfoque wholemount tiene varias ventajas sobre las técnicas clásicas de corte, tanto en la prestación de vistas panorámicas con el microscopio de baja potencia y una perspectiva completa de las células individuales con el microscopio de alta potencia. Esta técnica seguirá siendo un importante complemento a los estudios de futuro de esta zona del cerebro germinales adultas.

Figura 1. Red de cadenas migratorias neuronal en la SVZ. Azulejos imágenes confocal reconstruir una wholemount pared lateral que se tiñeron con anticuerpos para doublecortin, que las etiquetas de los neuroblastos emigran a lo largo de la SVZ. Hay dos corrientes generales de la migración, un funcionamiento más dorsal y ventral uno corriendo alrededor del punto de adherencia, indicado por el asterisco (*). Las flechas indican la anterior (a) y dorsal (d) las direcciones. Barra de escala = 1 mm.

Figura 2. Relación entre el sistema vascular y las células en división en la SVZ. Este lateral wholemount pared se immunostained con anticuerpos para Ki67, para etiquetar células que se dividen en verde, y los anticuerpos contra inmunoglobulinas de ratón, a la etiqueta de la vasculatura en rojo. Debido a que este wholemount no fue perfundido con solución salina antes de la tinción, las moléculas de IgG endógena ratón permanecer dentro de los vasos sanguíneos y se tiñen de secundaria anticuerpos anti-ratón. Un trabajo reciente sugiere que la división de los precursores SVZ (verde) se encuentran en las proximidades de los vasos sanguíneos (rojo) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522}. Las flechas indican la anterior (a) y dorsal (d) las direcciones. Barra de escala = 1 mm.

Figura 3. La superficie apical del ventrículo-ponerse en contacto con las células en la pared lateral. Imagen confocal de alta potencia de un wholemount immunostained de β-catenina, para etiquetar las membranas celulares en verde, y γ-tubulina, para etiquetar los cuerpos basales de color rojo, revela que la organización plana de estas células epiteliales. Las células de tipo B1, las células madre neurales adultas, tienen una pequeña superficie apical con un cuerpo basal único, indicado por las flechas. La superficie apical de estas células está rodeado de la gran superficie apical de las células ependimarias en una configuración de molinillo de viento. Las células ependimarias tienen polaridad plano indicado por la posición de sus cuerpos múltiples basal en la superficie apical. Vecinos células ependimarias tienen sus grupos basal del cuerpo se encuentra en el mismo lado de la superficie apical (hacia abajo y hacia la izquierda en esta región), correspondiente a la dirección del flujo del LCR {Mirzadeh, 2010 # 6573}. Barra de escala = 10 micras.

Figura 4. La prueba de flujo ependimarias. Imagen compuesta creada mediante la fusión de 100 fotogramas secuenciales a partir de una película tomada durante el ensayo de flujo ependimarias. Microesferas fluorescentes depositadas dorsal y posterior a la zona de adherencia fueron impulsadas por los cilios ependimarias en dos corrientes orientadas, sobre una y otra debajo de la adhesión, hacia el agujero de Monro. Este flujo orientado revela la polaridad funcional plana de células ependimarias. Cada línea de flujo muestra la posición de una sola cuenta en los puntos consecutivos en el tiempo. Barra de escala = 0,5 mm.

Figura 5. GFAP + células de tipo B1 tiene una fibra larga basal con fines de pies en los vasos sanguíneos. Proyección máxima de una pila de alta potencia confocal tomado de una pared lateral wholemount immunostained con anticuerpos GFAP para etiquetar los astrocitos SVZ. Esta tinción etiquetas de células madre neurales adultas o células de tipo B1, que tiene un final apical en la superficie ventricular, y como se muestra aquí, un largo GFAP + fibra basal que termina en los vasos sanguíneos (flechas). Los vasos sanguíneos están manchadas aquí porque el anticuerpo secundario utilizado para visualizar el ratón anti-GFAP anticuerpos reconocen IgG endógena del ratón dentro de la vasculatura. Barra de escala = 50 micras.

Discussion

La mayoría de los estudios de la neurogénesis en zonas ventricular y subventricular se han basado en las técnicas clásicas de corte para examinar la microanatomía y de las relaciones celulares en estas regiones. A continuación se describe una técnica alternativa, utilizó por primera vez para analizar la red de cadenas migratorias de los neuroblastos generados en la SVZ ^1, entonces se utiliza para estudiar la regeneración de la población de progenitores SVZ después de un tratamiento anti-mitótico ^6, y más recientemente para estudiar la precisión apical y basal interacciones célula-célula de células adultas de la SVZ madre neurales ^2,3,4. Curiosamente, esta técnica ha revelado que las células madre neurales, o las células de tipo B1, de la SVZ adultos forman parte de un neuroepitelio mezclado con diferencia que no se dividen las células ependimarias. En la cara de imagen usando wholemounts ha demostrado que esta mezcla tiene una arquitectura neuroepitelio molinete formado por las terminaciones apicales de las células de tipo B1 y rodeado de grandes superficies apicales de las células ependimarias ^4. Este análisis en cara ha aclarado nuestra comprensión del linaje de células madre neurales en el cerebro embrionario y adulto como un conjunto de células con terminaciones en la superficie apical del ventrículo y procesos basal en contacto con un nicho vascular. Estos hallazgos han sido casi imposible con las técnicas clásicas de corte. Wholemounts también facilitar la identificación de las células madre neurales a través de su ventrículo-ponerse en contacto con el proceso apical. Como los marcadores más específicos de estas células madre se encuentran, wholemounts será una parte integral de la identificación y análisis del comportamiento de las células madre neurales.

Wholemounts de las paredes del ventrículo lateral también ofrecen la perspectiva ideal para el estudio de la polaridad plana de células ependimarias. Las células ependimarias son las células de revestimiento de los ventrículos multiciliated que la función de impulsar CSF de manera coordinada. Con la técnica de wholemount, el epitelio ependimario completa está expuesta en la cara y se puede teñir y estudiado ampliamente desde su anterior a las fronteras ventral posterior y dorsal al. Además, los ensayos realizados en el flujo de ependimarias aguda disección, wholemounts vivir con firmeza demostrar el flujo plano polarizado generada por los cilios ependimarias. Un trabajo reciente utilizando enfoques wholemount ha descubierto determinantes celulares de este ependimarias polaridad plana ^5. Curiosamente, los estudios wholemount también han sugerido que ependimarias-generó un flujo de CSF establece gradientes de chemorepellents que guían la migración de las neuronas jóvenes en la SVZ ^7. Enfoques wholemount que inicialmente identificó la red de cadenas migratorias neuronal, por lo tanto continuar proporcionando pistas sobre los mecanismos que regulan la migración en cadena.

El análisis de los VZ y SVZ por wholemount imágenes añade un nuevo enfoque para los estudios de futuro y una forma de clarificar nuestra comprensión de los estudios existentes. Por ejemplo, un estudio reciente sugiere que las células madre neurales en la SVZ adultos fueron CD133 + / CD24-células en contacto con el ventrículo ^8. En base a su tinción en secciones, estos autores afirman que estas células eran una subpoblación de células ependimarias multiciliated. Sin embargo, en nuestro estudio, utilizando el enfoque wholemount, lo que da una visión más completa del epitelio ependimario todo, encontramos que todas las células ependimarias expresan CD24 y el único ventrículo-ponerse en contacto con las células que fueron CD133 + / CD24-fueron un subconjunto de tipo B1 las células ^4. Además, la técnica wholemount promete ser útiles en futuros estudios que examinen la organización del mosaico descrito recientemente de las células madre neurales en el cerebro adulto ^9. Varios estudios han demostrado que las células madre neurales en el cerebro adulto no son una población homogénea, sino que se especifican a nivel regional y normalmente sólo producen subtipos específicos de las interneuronas bulbo olfatorio. Estos estudios han propuesto que las diferentes subpoblaciones de células madre neurales pueden ser distinguidos, ya sea por la expresión de factores de transcripción específicos ^{10,11,12,13,14} y / o por su localización regional a lo largo de la extensión dorsal-ventral y antero-posterior de la pared lateral ^9,15,16. A medida que más marcadores moleculares de las subpoblaciones regionalmente específico de células madre neurales adultas se identifican, imágenes wholemount debe proporcionar una visión completa de la parcelación de estos dominios progenitoras diferentes a lo largo de la pared ventricular.

La disección wholemount y técnicas de imagen que aquí se presenta puede ser utilizado para analizar las paredes ventriculares en el embrión. La disección de la pared lateral de embriones se lleva a cabo, paso a paso, de la misma manera. Sólo hay pequeñas diferencias en el nivel de dificultad, los ventrículos embrionarias son relativamente más grandes haciendo la disección más fácil, pero el tejido es más suave haciendo más difícil la manipulación. En particular, una exposición similar del ventrículo lateral se puede utilizar en Embryos para disecar la pared cortical del ventrículo para estudiar la neurogénesis cortical. La evidencia reciente sugiere que la herencia asimétrica del centrosoma mantiene glía radial en la superficie ventricular durante la neurogénesis cortical ^17. En-frente a imágenes de la superficie apical radial gliales pueden proporcionar ideas sobre cómo centrosomas dentro de estas células que se dividen asimétricamente son heredados.

Como con la mayoría de las técnicas, especialmente las relacionadas con la destreza precisa, la maestría requiere de práctica. Hay, sin embargo, algunos elementos en la disección que son clave para obtener mejores resultados: 1) el ajuste de iluminación de la iluminación de la muestra para crear sombras ofrece un contraste muy valiosa durante la disección de tejido que es de otra manera relativamente homogénea, 2) el uso de los fórceps como dos pasadores de insectos en las pinzas de esta técnica no se utilizan para apretar juntos o recoger a los tejidos, sino que se utilizan como pasadores maniobrable que se pueden reajustar continuamente para estabilizar el tejido durante el corte, 3) un balance de retracción suave y el corte del cuchillo no debe sólo se utiliza para cortar, sino también para proporcionar la retracción suave para separar las paredes medial y lateral, recordando que la mayoría de la disección, se efectúa a través de la retracción suave con sólo el corte intermitente.