Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

المنطقة Subventricular اون الوجه : يلطخ Wholemount والتدفق البطانة العصبية

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

جدران البطين الجانبي تحتوي على أكبر منطقة جرثومي في دماغ الثدييات الكبار. تقليديا ، وقد اعتمدت الدراسات على تكوين الخلايا العصبية في هذه المنطقة على التقنيات الكلاسيكية للتحليل النسيجي sectioning. هنا نقدم نهجا بديلا ، والتقنية wholemount ، الذي يوفر شاملة ، ان وجه نظرا لهذه المنطقة جرثومي.

Abstract

جدران البطينين الجانبية تحتوي على أكبر منطقة جرثومي في دماغ الثدييات الكبار. منطقة subventricular (SVZ) في هذه الجدران هي نظام نموذجي درس على نطاق واسع لفهم سلوك الخلايا الجذعية العصبية وتنظيم الخلايا العصبية الكبار. تقليديا ، وقد اعتمدت هذه الدراسات على التقنيات الكلاسيكية للتحليل النسيجي sectioning. هنا نقدم نهجا بديلا ، والتقنية wholemount ، الذي يوفر شاملة ، ان وجه نظرا لهذه المنطقة جرثومي. مقارنة المقاطع ، wholemounts الحفاظ على علاقات كاملة والتهندس الخلوي الخلوي داخل SVZ. وقد كشفت مؤخرا ان هذا النهج الكبار الخلايا الجذعية العصبية ، أو خلايا B1 اكتب ، هي جزء من خلايا الظهارة العصبية مختلطة مع بطانة البطانة العصبية متباينة البطينين الجانبية. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذا النهج لدراسة الاستقطاب مستو من الخلايا البطانة العصبية وتدفق السائل النخاعي أنها تولد في البطين. مع أدلة حديثة أن الخلايا الجذعية العصبية الكبار هم من السكان غير المتجانسة الذي تم تحديده على الصعيد الإقليمي ، فإن النهج wholemount من المرجح أن تكون أداة أساسية لفهم تنظيم وparcellation هذه الخلية الجذعية المتخصصة.

Protocol

أولا إعداد Micropipettes زجاجية مملوءة Microbeads نيون الفحص عن تدفق البطانة العصبية (قد يتم تخطي هذه الخطوات إذا كان لأغراض إعداد wholemounts التلوين فقط).

  1. تأمين الزجاج Wiretrol المجاهدين 5 الأنابيب الشعرية على الزجاج micropipette مجتذب وضبط إعدادات جهاز التدفئة واللولبي لسحب ماصة مع تفتق ، على نحو سلس الضحلة.
  2. إرفاق مصدر ضغط الهواء الايجابي على نهاية micropipette انسحب بلطف وانخفاض غيض من ماصة على سطح المعدن صريف بزاوية 45 درجة لخلق مشطوف الحافة. ضغط الهواء الايجابي يساعد على ازالة الانقاض والزجاج من الداخل من ماصة. نظيفة في نهاية الحافة مشطوف مع الأنسجة الايثانول مبلل.
  3. دراسة غيض من ماصة تحت المجهر مع ميكرون. وينبغي أن يكون الطرف شطبة السلس مع فتح قطرها الداخلي أم 100 ~. ويمكن استخدام أصغر أقطار ولكن غالبا ما تؤدي إلى انسداد ماصة مع حبات الفلورسنت.
  4. الردم ماصة مع الزيوت المعدنية حتى الشبع نصف ، ثم إدراج الشحوم ، انخفض الى المكبس الخلفي من ماصة. هلالة مسبقة من الزيوت المعدنية إلى الطرف عن طريق دفع ماصة يدويا في المكبس.
  5. تأمين micropipette والمكبس في الصعود إلى micromanipulator ، ثم المسمار حامل ماصة micromanipulator على ذراع ثابتة الصغيرة مع ارتفاع قابل للتعديل.
  6. أمامية ماصة مع الحل microbead الفلورسنت ، والتي تتكون من 50 ٪ الفلورسنت microbead محلول المخزون ، و 45 ٪ ماء ، والجلسرين 5 ٪. يضاف الجلسرين لزيادة كثافة المحلول بحيث عندما أودعت وعلى wholemount microbeads في بالوعة على السطح.
  7. ضع micromanipulator في مكان آمن حيث لا يمكن كسرها الإبرة بطريق الخطأ والشروع في تشريح wholemount.

II. Wholemount تشريح والتثبيت

  1. للتحضير لتشريح wholemount ، وكمية كافية من دفء L - 15 وسائل الإعلام ليبوفيتش إلى 37 درجة مئوية. وسوف تحتاج ما يقرب من 10 مل لكل حيوان كنت تخطط لتشريح. كما جمع كل اللوازم التي سوف تحتاج لتشريح والتثبيت من قبل stereomicroscope : مقص ، ملقط كبيرة مسننة ، ملقط ملساء ناعمة ، Sharpoint 22.5 ° طعنة سكين المجهرية ، طبق تشريح ، منشفة ورقية ، وحقيبة واقية ، وكذلك 24 لوحة على الجليد مملوءة 4 ٪ بارافورمالدهيد مع أو بدون 0.1 ٪ تريتون X - 100. يستخدم تريتون X - 100 لتقليل التوتر السطحي لمحلول PFA ، مما يقلل من حدوث القص عند السطح wholemount تخبط في هذا الحل.
  2. صب 50-10 مل من وسائل الإعلام تحسنت في طبق تشريح ضعت تحت stereomicroscope الفلورسنت. يتم إعداد أطباق تشريح بصب an البوليمر مرونة ، ودعا Sylgard 184 ، في طبق من البلاستيك 6 سم والسماح للشفاء حل البوليمر ل1 أسبوع تحت فراغ ، ثم شطف الأطباق جيدا بكميات كبيرة من الماء قبل استخدامه. عادة ، وتركنا الأطباق نقع في الماء في دورق L 1 : 1 في الاسبوع.
  3. هو التضحية الحيوانية خلع عنق الرحم وقطع الرأس.
    ملاحظة : إذا كان المطلوب ، قد يتم مسح الدم من الأوعية الدموية التي perfusing الحيوان بالمحلول الملحي العادي من قبل تشريح الدماغ. هذا مهم بشكل خاص إذا يؤدون immunostaining مع مولد اللون diaminobenzidine (DAB).
  4. يتم إجراء شق خط الوسط ، لالأمامي الخلفي ، جنبا إلى جنب في فروة الرأس للكشف عن الجمجمة.
  5. يتم إجراء سلسلة من التخفيضات في 4 الجمجمة لفتح الجمجمة : واحد قطع يمتد مدارات two المصابيح الأمامية لحاسة الشم ، واثنين من التخفيضات المقبلة هي أقل شأنا من المخيخ وفصل الجمجمة من قاعدة الجمجمة ، ويدير قطع النهائي الأمامي الخلفي للخياطة على طول منتصف السهمي.
  6. وتراجع بلطف اللوحات الجمجمة ويتم استخراج الدماغ وتوضع في طبق تشريح.
  7. يتم تنفيذ ما تبقى من تشريح تحت stereomicroscope. أولا ، يتم تشريح بصيلات الشم بعيدا عن الدماغ. إذا كنت ترغب بالإضافة إلى دراسة بصيلات الشم ، وإصلاح ببساطة عن طريق الغمر في 4 ٪ PFA بين عشية وضحاها وبعد ذلك يمكنك ان تعد لهم لsectioning والتلوين.
  8. تقسيم الدماغ على طول الشق بين نصفي المخ.
  9. يتم بعد ذلك قطع coronally المنحى في الجانب الخلفي ، وينتمي معظم الشق بين نصفي المخ ، والسماح للالحصين عجزي أن تصور في المقطع العرضي.
  10. ثم يجب أن قرن آمون ، الذي يشكل الجدار الإنسي للبطين الوحشي في هذا الموقف ، ستصدر من القشرة الفوقية ، التي تشكل الجدار الظهري الجانبي للبطين. أولا ، يتم إدخال سكين في مساحة صغيرة بين البطين القشرة والحصين ظهريا ، ويتم إجراء خفض في القشرة حيث أنه يعكس ventrally ، بعيدا عن خط الوسط ، للانضمام إلى الحصين. بعد إجراء هذا الخفض ، يمكن القشرة مقشرة ببطء بعيدا عن الحصين للكشف عن الانتقال من البطين الجانبي لالظهرية البطنية. هذه المناورة هوالتعجيل بقطع اسفين من القشرة في الزاوية حيث تم الإفراج عن الحصين. بعد بلوغ حد أقصى البطني للبطين الوحشي في هذا الموقف ، قد تصور أو يشعر فيها القشرة مرة أخرى يلتف حولها ، وتعكس هذه المرة يعود بشكل إعلامي ، للانضمام إلى الحصين. يجب أن يتم خفض آخر في هذا المنصب لاطلاق سراح تماما الحصين أو جدار وسطي للبطين الوحشي من القشرة أو الجدار الجانبي من البطين الجانبي.
  11. سيكون من السهل بعد ذلك لسحب الحصين بعيدا عن القشرة ، إعلامي والأمامية ، لفتح بطين الوحشي على نطاق واسع.
  12. تواصل برفق باستخدام الحصين الأمامية صغيرة من السكتات الدماغية والملقط لسحب سكين الجدران الإنسي والجانبية بعيدا.
  13. مرة واحدة في مقاومة هذا التراجع يبدأ في الزيادة ، وهناك حاجة إلى تخفيضات إضافية. أولا ، زيادة التعرض للبطين الوحشي وعلى وجه الخصوص ، والجدار الجانبي وSVZ ، بعيدا تشريح القشرة. يتم تشريح القشرة نظيفة بعيدا من الرؤية والتفاعل بين الجسم الثفني وVZ / SVZ. قطع على طول هذه الواجهة ببساطة البقاء على الجانب الثفني لتجنب إتلاف SVZ.
  14. من أجل مواصلة التراجع الجدار الإنسي بعيدا عن الحائط الجانبي ، وهناك حاجة لاثنين من أكثر التخفيضات : واحد قطع ظهريا حيث الجدار الجانبي ، الجدار الإنسي ، والقشرة تتلاقى جميعا ، وقطع واحد ventrally حيث الجدار الجانبي ، الجدار الإنسي ، والمهاد تتقارب. مع هذه التخفيضات التي أجريت ، كذلك تراجع لطيف على الجدار الإنسي يسمح فتح الأمامي مدى أكثر من البطين الجانبي.
  15. الإضاءة المناسبة أمر ضروري في جميع أنحاء الداخلي وخصوصا في الخطوة التالية ، حيث يتم فصل الجدران الإنسي والجانبية الأمامية. في هذا الموقف الأمامي في البطين الجانبي ، والجدار الخلفي الإنسي يعكس ومستمر مع الجدار الجانبي. ضبط الإضاءة مثل هذه الظلال بين الجدارين تكشف عن انعكاس هذه النقطة ، وهو ما يبدو وكأنه وادي بين الجدارين. قطع بالضبط في هذا الوادي لفصل هذه الجدران اثنين.
  16. أخيرا ، كشف تماما الجدار الجانبي من خلال إزالة أي القشرة يخيم ظهريا والمهاد وventrally.
  17. إذا كان يستعد لwholemounts immunostaining ، ونقل بعناية wholemount ، جنبا البطين أعلى ، من الطبق تشريح الى 24 لوحة مليئة جيدا PFA 4 ٪ مع أو بدون 0.1 ٪ X100 - تريتون لتثبيت بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. لمستضدات - الحساسة التثبيت ، قد تكون ثابتة wholemounts لفترات زمنية أقصر. ثم الشروع في القسم 4 في wholemounts immunostaining.
  18. إذا كان يستعد لتحليل تدفق wholemounts البطانة العصبية ، ونقل إلى wholemount طبق تشريح نظيفة مليئة الطازجة والمتوسطة يبوفيتش C ° 37 وانتقل إلى المقطع التالي.

III. البطانة العصبية باستخدام تحليل التدفق Microbeads نيون

  1. شل wholemount على طبق نظيف تشريح 2 باستخدام دبابيس الحشرات ، واحدة في واحدة في المهاد الأمامي الظهري ركن من أركان wholemount.
  2. وضع قاعدة ثابتة للذراع عقد micromanipulator بجوار stereomicroscope. تأكد من رفع الحد الأقصى لارتفاع ذراع قابل للتعديل لتجنب كسر إبرة ضد طبق تشريح.
  3. تراجع بعناية غيض من الإبرة في وسائل الإعلام في أنبوب ependorf لتنظيف قبالة microbeads التي تكون موجودة على الطرف الخارجي للإبرة. إذا لم يتم تنظيف هذه المسافة ، قد أودعت في وقت لاحق أن تكون على سطح wholemout دون قصد خلال إبرة المواقع ويقلل من جودة الشاملة للفيلم.
  4. موقف طرف الإبرة على السطح الظهري من الجدار الجانبي والسفلي للذراع لجلب رأس الإبرة في المتوسط. ينبغي تخفيض الإبرة حتى يتم فقط فوق سطح الجدار الجانبي.
  5. مع إبرة في الموقف ، وضبط التكبير والتركيز على stereomicroscope لتغطية الحقل المطلوب. إذا كنت سوف تبذل تسجيل تدفق البطانة العصبية ، ستبدأ بالحصول على الصور في هذا الوقت.
  6. إخراج ~ 5 NL من الحل microbead على سطح wholemount. مرة واحدة تم مسح البلعة الأولية من الخرز قبالة السطح تدفق البطانة العصبية ، يمكن إجراء جولات إضافية من طرد حبة.

رابعا. Immunostaining Wholemounts

  1. Wholemounts تشريح لimmunostaining والغمر الثابتة بين عشية وضحاها في PFA 4 ٪ مع أو بدون 0.1 ٪ تريتون - X100 في 4 درجة مئوية. ويفضل استخدام X100 - تريتون لمستضدات التي تتسامح مع هذا العلاج ، ولكن يمكن استبعاده في الحالات التي تراجع نوعية التلوين بواسطة المنظفات.
  2. في صباح اليوم التالي ، ويستنشق PFA من 24 لوحة جيدا ويغسل wholemounts 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل برنامج تلفزيوني 0.1 M مع أو بدون 0.1 ٪ تريتون - X100. كما كان من قبل ، ويفضل استخدام X100 - تريتون ، ولكن ليس المطلوب ، بالنسبة لجميع يغسل في هذا البروتوكول. طوال هذا البروتوكول ، وتبادل الحلول على كاملجبل الطموح يتطلب حذرا من الحل من جانب البئر. ثم ، يتم ملء البئر مع الحل باستخدام ماصة نقل هذه الزاوية أن الحل يغسل على الجانب مباشرة من البئر لم يكن كذلك ، وعلى wholemount. العناية للحفاظ على الجانب البطين للwholemount مواجهة في جميع الأوقات. سوف pipetting قوية من الحلول في كثير من الأحيان wholemount الوجه. نحن نفضل الحلول لتبادل أكثر من 1 wholemount في وقت واحد لمنع الأنسجة من التجفيف.
  3. بعد غسل قبالة PFA ، يتم تحضين wholemounts لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في حل حظر ، التي تحتوي على الماعز العادي 10 ٪ أو مصل حمار في برنامج تلفزيوني 0.1 M مع أو بدون X100 - تريتون. إذا باستخدام تريتون - X100 للتلوين ، قد اخترت استخدام إما 2 ٪ أو 0.5 ٪ تريتون - X100 في حل حظر. نستخدم 2 ٪ تريتون - X100 عندما تلطيخ لمولدات المضادات التي تتطلب أعمق اختراق الأجسام المضادة في الأنسجة ، مثل تلك الموجودة في مستضدات SVZ. ومع ذلك ، عندما تلطيخ لمستضدات تقع أقرب إلى سطح الجدار الجانبي ، مثل مستضدات موجودة على سطح خلايا البطانة العصبية القمي ، ونحن نستخدم 0.5 ٪ تريتون - X100. بالإضافة ، يمكن ترك تريتون - X100 خارج عن سطح الخلية أو مولدات المضادات الأخرى التي يتم إزالتها أو تعديلها بواسطة المنظفات.
  4. المقبل ، وإزالة الحجب وإضافة محلول الأجسام المضادة الأولية مخففة في نفس الحل الحجب واحتضان لمدة 24 أو 48 ساعة على 4 درجات مئوية. اختيار فترة الحضانة يعتمد على المستضد ، مماثلة لاختيار 0.5 ٪ أو 2 ٪ تريتون. لالمستضدات الموجودة على سطح wholemount ، يكفي حضانة 24 ساعة. ومع ذلك ، لمستضدات تقع أعمق ، كما هو الحال في SVZ ، وفترات الحضانة لمدة 48 ساعة تقديم أفضل النتائج.
    على سبيل المثال ، لدراسة سطح قمية والهيئات القاعدية للخلايا المبطنة للجدار البطين الجانبي ، وصمة عار مع الأجسام المضادة للcatenin - β ، لتسمية غشاء الخلية ، وγ - تويولين ، لتسمية الهيئات القاعدية. تمييع الماوس المضادة للβ - catenin الأضداد (1:500) والمضادة للأرنب γ - تويولين الأضداد (1:1000) في 0.1 م PBS تحتوي على 10 ٪ مصل الماعز العادية و 0.5 ٪ تريتون - X100. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    وصمة عار على الكبار الخلايا الجذعية العصبية ، أو خلايا B1 نوع ، وصمة عار على الجدار الجانبي مع الضد GFAP. تمييع الماوس المضادة للGFAP الأضداد (1:500) في 0.1 م PBS تحتوي على 10 ٪ مصل الماعز العادية و 2 ٪ تريتون - X100. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  5. يتم غسل الأجسام المضادة الأولية بنسبة 2 في البداية قبالة يشطف سريعة في برنامج تلفزيوني مع أو بدون 0.1 ٪ تريتون - X100. ثم القيام 3 يغسل إضافية لمدة 20 دقيقة كل في درجة حرارة الغرفة.
  6. تمييع الأجسام المضادة الثانوية في نفس الحل حظر استخدام الأجسام المضادة لالابتدائي وإضافة إلى wholemounts لاحتضان لنفس المدة من الوقت بالنسبة للأضداد الابتدائية في 4 درجات مئوية.
    على سبيل المثال ، لتلطيخ catenin - β وγ - تويولين : تمييع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للأضداد الفأر (1:400 ، وتسلم الماوس المضادة للβ - catenin) واليكسا فلور 594 ماعز أضداد الأرانب (1:400 ، تسلم أرنب المضادة للγ - تويولين) في 0.1 م PBS تحتوي على 10 ٪ مصل الماعز العادية و 0.5 ٪ تريتون - X100. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    لimmunostaining GFAP : تمييع اليكسا فلور 488 الماعز المضادة للأضداد الفأر (1:400 ، وتسلم الماوس المضادة للGFAP) في 0.1 م PBS تحتوي على 10 ٪ مصل الماعز العادية و 2 ٪ تريتون - X100. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  7. يتم غسل الأجسام المضادة الثانوية قبالة wholemount باستخدام يغسل نفسه يؤديها عن الأجسام المضادة الأولية.
  8. إذا رغبت في ذلك ، يمكن إجراء مكافحة تلطيخ النووية في هذه المرحلة التي يحتضنها دابي مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم غسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني.

خامسا تركيب Wholemounts Immunostained على شرائح مجهرية لمتحد البؤر

  1. مبائر للتصوير عالي الدقة ، وبعد أن immunostaining wholemounts يلزم الفرعي تشريح فقط للحفاظ على الجدار الجانبي للبطين الوحشي باعتباره قطعة من نسيج 200-300 ميكرون سميكة. يفصل الجدار الجانبي من المخطط الأساسي يسمح تثبيته على شريحة ومغطاة ساترة بطريقة مسطحة.
  2. عودة الى stereomicroscope مع wholemounts immunostained والأدوات والمعدات التالية : ملقط ملساء ناعمة ، Sharpoint 22.5 ° طعنة سكين المجهرية ، طبق تشريح ، والشرائح المجهر وcoverslips ، 0.1 M برنامج تلفزيوني ، وAquamount المتوسطة المتزايدة.
  3. نقل wholemount من 24 لوحة جيدا لالطبق يحتوي على 0.1 م تشريح PBS الحرص للحفاظ على الجانب البطين أعلى.
  4. أولا ، إزالة القشرة الظهرية للwholemount الخلفي من لالأمامي عن طريق خفض بالضبط على طول الخط حيث يلتقي الجسم الثفني الجدار الجانبي. ومن المسلم به أن هذا هو واجهة بين المادة البيضاء الثفني وSVZ الوردي الظهور.
  5. ثم إجراء خفض طويلة أفقيا المنحى عبر الجانب البطنية من wholemount. وخفض هذا السطح على توفير منصة التي يمكنك شabilize في wholemount خلال الخطوة التالية في تشريح.
  6. مع السطح الظهري للwholemount مواجهة ، وسوف تكون قادرة على تصور سمك SVZ الأمامي إلى الخلفي من طول الجدار الجانبي. علما أنه تم إجراء هذا الرأي ممكن عن طريق إزالة القشرة الأولي السماح ينظر إلى المخطط الأساسي وSVZ. يتم تعريف كما SVZ الفرقة رقيقة من الأنسجة التي تمتد من سطح البطين إلى المخطط. وSVZ لها مظهر متجانس الوردي حين تسللت إلى المخطط بواسطة الحبال من المادة البيضاء. علما بأن SVZ الأمامية هي أكثر سمكا ، وتصبح أرق تدريجيا خلفي.
  7. وبمجرد الانتهاء من تحديد واجهة من وSVZ المخطط ، تبدأ القطع بعناية في هذه الواجهة في الجانب الأمامي معظم الجدار الجانبي ، والنهوض السكين من ظهري إلى بطني. للقيام بذلك بدقة ، وتحقيق الاستقرار في wholemount بالملقط الخاص تستخدم اثنين من المسامير. يمكنك أيضا استخدام الملقط الخاص لتحويل قليلا wholemount لتصور شفرة تتقدم من ظهري لبطني عبر الجدار الجانبي. المفتاح لهذا هو تشريح لشريحة الناتجة من الأنسجة لتكون مسطحة للغاية. وهذا يعني أنه عند شريحة قبالة SVZ الأمامي إلى الخلفي من عبر الجدار الجانبي ، واتجاه من التخفيضات التي تجريها يجب أن تظل موازية لسطح البطين في جميع الأوقات.
  8. تذكر أن أكثر الخلف ، وSVZ يصبح أرق. بدلا من التخفيف من تشريح الخاص بقطع SVZ فقط عند هذه النقطة ، فمن المهم أن كما كنت مسبقا خلفي ، وسمك يجري تشريح الأنسجة لا يزال هو نفسه. وهذا تأكد من أن قطعة من النسيج سوف يشن في وقت لاحق مسطحة.
  9. بعد الفصل الكامل بين الجدار الجانبي من المخطط الأساسي ، وإزالة بعناية جميع الأنسجة الأخرى المحيطة من هذه القطعة التي لا تشكل جزءا من الجدار البطيني.
  10. ثم التقط هذه القطعة من استخدام الملقط الخاص دون وضعه في وسط شريحة المجهر. تطبيق بضع قطرات من aquamount مباشرة على wholemount ومكان بلطف ساترة طيرانها فوق هذا ، لا تحاول أن أعرض فقاعات على سطح النسيج. سوف وزن الشريحة ضمان يشتت aquamount بالتساوي وسوف ينتج تسطيح المكرر من سطح الجدار الجانبي. كمية aquamount المستخدمة وحجم ساترة تعتمد على عمر يجري تشريح الأنسجة. لالأنسجة الجنينية بعد الولادة والمبكر ، ونحن نفضل 1 قطرة من aquamount و22 "× 30" ساترة. قد أثقل coverslips تشويه النسيج وأكثر aquamount سوف تتداخل مع نوعية التصوير لأن الليزر مبائر ستكون أقل قدرة على اختراق طبقة رقيقة من aquamount المقيمين بين ساترة وسطح الأنسجة. للأنسجة في وقت لاحق بعد الولادة وتعليم الكبار ، ونحن نستخدم 4 قطرات من aquamount و24 "× 60" ساترة.
  11. ثم يتم تخزين الشرائح المسطحة في كتاب الشريحة عند 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام قبل التصوير للسماح لتسوية coverslips.

ممثل النتائج

وقد وفرت النهج Wholemount أفكار أساسية عدة في نشاط جرثومي من SVZ الكبار. ولوحظ لأول مرة شبكة من سلاسل من الخلايا العصبية المهاجرة الشابة في SVZ بعد wholemounts الجدار الجانبي للبطين الوحشي وimmunostained مع الأجسام المضادة للخلايا العصبية polysialylated التصاق جزيء (PSA - NCAM) 1. ويمكن أيضا هذه السلاسل من neuroblasts المهاجرة بعد أن ينظر immunostaining wholemounts مع الأضداد doublecortin (الشكل 1). بشكل ملحوظ ، وشبكة من السلاسل ونمط نمطية ، مع اثنين من التيارات العامة للخلايا ، واحدة تعمل على ظهريا واحد يشغل ventrally حول نقطة الالتصاق. Wholemounts من SVZ أيضا تقديم نظرة شاملة عن النشاط التكاثري للأسلاف في هذه المنطقة ، كما رأينا مع Ki67 تلطيخ في الشكل 2. ومن المثير للاهتمام ، واثنين من الدراسات الحديثة تشير إلى تفاعل وثيق بين الخلايا SVZ تقسيم والأوعية الدموية المحلية 2،3 (الشكل 2).

عند فحصها تحت المجهر مبائر الطاقة العالية ، عن رأي مفاده ان وجه تقدمها wholemounts يتيح منظورا فريدا من سطح قمية من الخلايا المبطنة للنظام البطين. وكشفت ان هذا المنظور وجه مؤخرا أن الخلايا SVZ B1 ، اكتب الكبار الخلايا الجذعية العصبية ، هي جزء من خلايا الظهارة العصبية مختلطة مع تقسيم البطانة العصبية غير المتمايزة 4. ويحيط السطح القمي من نوع B1 الخلايا الاتصالات البطين الجانبي والسطوح قمية كبيرة من خلايا البطانة العصبية في تكوين الدولاب على الهواء (الشكل 3 ، تشير الأسهم السطوح قمية B1). وعلاوة على ذلك ، فقد كشفت دراسة دقيقة لسطح خلايا البطانة العصبية قمي ان هذا الموقف والتوجه متعدية التناوب هيئاتها القاعدية هي مؤشرات من الاقطاب على مستو 5. البطانة العصبية الخلايا القاعدية بو تتجمع يموت في التصحيح على السطح القمي. هذا التصحيح هو النازحين من وسط السطح القمي في الاتجاه "المصب فيما يتعلق بتدفق السائل النخاعي (قطبية متعدية) ؛ ضمن هذا التصحيح ، كل الجسم القاعدية هو استدارة حول محورها طويل بحيث القدم القاعدية ، ملحق للالقاعدية الجسم ، ونقطة في اتجاه التدفق (قطبية التناوب). خلايا البطانة العصبية المجاورة لها هيئاتها القاعدية موجهة في نفس الاتجاه. والأهم من ذلك ، يمكن استخدام videomicrographs للمقايسة تدفق البطانة العصبية للمقارنة بشكل مباشر على تدفق المياه في منطقة معينة من الجدار الجانبي التوجه إلى الهيئات الخلية القاعدية البطانة العصبية في تلك المنطقة (الشكل 4).

بالإضافة إلى توفير منظور بانورامية لمنطقة أكبر جرثومي في الدماغ الكبار ، والتصوير مع أعلى سلطة ، wholemounts تسمح لمزيد من التحليل الكامل والمفصل لmorphologies الخلوية الفردية في SVZ. وقد كشف التصوير عالية من الطاقة مبائر immunostaining GFAP wholemounts على أن الخلايا B1 نوع ، بالإضافة إلى هذه الأمور قصير بطين ، عملية الاتصال القمي ، وعملية طويلة القاعدية في اتصال مع الأوعية الدموية (الشكل 5) 4. لم يكن هذا التقدير من قبل التهندس الخلوي في الفروع الاكليلية لأن عملية القاعدية يسير بمحاذاة الجدار في معظمه إلى البطين. sectioning المسلسل تخفيضات بالتالي الخلايا الفردية إلى أجزاء صغيرة ، مما يجعل من المستحيل تقريبا لإعادة التشكل خلية ليالي كاملة ، أو لفهم علاقته أنواع الخلايا الأخرى في SVZ. نهج wholemount ديها العديد من المزايا أكثر من التقنيات التقليدية sectioning ، سواء في تقديم رؤية بانورامية مع المجهري منخفضة الطاقة ومنظور كاملة من خلايا فردية مع المجهري الطاقة العالية. وسوف تستمر هذه التقنية لتكون عنصرا مكملا هاما للدراسات المستقبلية لهذه المنطقة في الدماغ الكبار جرثومي.

الشكل 1
الشكل 1. سلاسل شبكة الخلايا العصبية الكثيرة في SVZ. صور مبائر تجانب إعادة بناء الجدار الوحشي wholemount أن ملطخة الأجسام المضادة لdoublecortin ، التي تصف neuroblasts المهاجرة في جميع أنحاء SVZ. هناك نوعان من الجداول العامة للهجرة ، واحد يشغل أكثر من واحدة ظهريا تشغيل ventrally حول نقطة الالتصاق ، التي أشار إليها العلامة النجمية (*). تشير الأسهم الأمامي (أ) و الظهرية (د) الاتجاهات. مقياس بار = 1 ملم.

الشكل 2
الشكل 2 : العلاقة بين الأوعية الدموية والخلايا المنقسمة في SVZ. وكان هذا immunostained wholemount الجدار الجانبي مع الأجسام المضادة للKi67 ، لتسمية الخلايا المنقسمة باللون الأخضر ، والأجسام المضادة المناعية ضد الفأر ، لتسمية الأوعية الدموية في الحمراء. لأن هذا لم يكن perfused wholemount مع المالحة قبل التلوين ، والذاتية الماوس جزيئات مفتش البقاء داخل الأوعية الدموية والتي هي ملطخة أضداد الفأر الثانوية. الأعمال الأخيرة تشير إلى أن تقع تقسيم السلائف SVZ (الأخضر) على مقربة من الأوعية الدموية (الحمراء) {شين ، 2008 # 6523} {Tavazoie ، 2008 # 6522}. تشير الأسهم الأمامي (أ) و الظهرية (د) الاتجاهات. مقياس بار = 1 ملم.

الشكل 3
الشكل 3. السطح القمي البطين - الاتصال الخلايا على الجدار الجانبي. immunostained صورة عالية الطاقة مبائر من wholemount لcatenin - β ، لتسمية أغشية الخلية باللون الأخضر ، وγ - تويولين ، لتسمية الهيئات القاعدية في الحمراء ، ويكشف المنظمة مستو من هذه الخلايا الظهارية. نوع الخلايا B1 ، الكبار الخلايا الجذعية العصبية ، وسطح الصغيرة قمية مع هيئة القاعدية واحد ، أشار إليه السهام. ويحيط سطح قمية هذه الخلايا عن طريق سطح قمية كبيرة من خلايا البطانة العصبية في تكوين الدولاب على الهواء. خلايا البطانة العصبية والاستقطاب مستو دلت عليه الموقف من أجسادهم القاعدية متعددة على سطح القمي. خلايا البطانة العصبية المجاورة لديهم كتل أجسامهم القاعدية الموجودة على الجانب نفسه من السطح القمي (الأسفل واليسار في هذه المنطقة) ، المقابلة لاتجاه تدفق السائل النخاعي {Mirzadeh ، 2010 # 6573}. مقياس بار = 10 ميكرومتر.

الشكل 4
الشكل 4 ، وفحص تدفق البطانة العصبية. خلق صورة مركبة عن طريق دمج 100 صورة تسلسلية من الفيلم التي اتخذت خلال فحص تدفق البطانة العصبية. أودعت microbeads الفلورسنت والدفع الخلفي وظهري إلى منطقة التصاق البطانة العصبية بواسطة أهداب في مسارين المنحى ، واحد على واحد في إطار التصاق ، نحو ثقبة مونرو. هذا التدفق المنحى يكشف قطبية مستو الوظيفية للخلايا البطانة العصبية. كل سطر تدفق يصور موقف حبة واحدة في نقاط متتالية في الوقت المناسب. مقياس شريط = 0.5 مم.

> الشكل 5
الشكل 5. GFAP + الخلايا B1 اكتب لها الألياف طويلة القاعدية مع نهاية القدمين على الأوعية الدموية. immunostained إسقاط الحد الأقصى لكومة عالية الطاقة مبائر مأخوذة من الجدار الجانبي wholemount مع الأجسام المضادة لتسمية GFAP النجمية SVZ. هذه التسميات تلطيخ الكبار الخلايا الجذعية العصبية ، أو خلايا B1 نوع ، والتي لها المنتهية قمية على سطح البطين ، وكما هو موضح هنا ، GFAP طويلة + الألياف القاعدية التي تنتهي في الأوعية الدموية (الأسهم). هي ملطخة الأوعية الدموية هنا لأن الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة لتصور الماوس المضادة للGFAP الأجسام المضادة الذاتية الاعتراف الماوس مفتش داخل الأوعية الدموية. مقياس بار = 50 ميكرومتر.

Discussion

وقد اعتمدت معظم الدراسات من الخلايا العصبية في مناطق البطين وsubventricular على تقنيات الكلاسيكية لدراسة sectioning microanatomy الخلوية والعلاقات في هذه المناطق. نحن هنا وصف أسلوب بديل ، استخدم لأول مرة لتحليل شبكة من السلاسل المهاجرة neuroblasts المتولدة في SVZ 1 ، ثم استخدمت لدراسة تجديد السكان السلف SVZ التالية المضادة للعلاج الإنقسامية 6 ، والتي تم استخدامها مؤخرا لدراسة دقيقة قمية والخلايا القاعدية خلايا تفاعلات الكبار الخلايا الجذعية العصبية SVZ 2،3،4. ومن المثير للاهتمام ، فقد كشفت هذه التقنية أن الخلايا الجذعية العصبية ، أو خلايا B1 ، اكتب من SVZ الكبار هي جزء من خلايا الظهارة العصبية مختلطة مع تقسيم غير متمايزة البطانة العصبية. وقد أظهرت ان وجه التصوير باستخدام wholemounts أن هذه الظهارة العصبية وهندسة الدولاب على الهواء مختلطة تتألف من النهايات قمية من الخلايا B1 اكتب محاطة السطوح قمية كبيرة من خلايا البطانة العصبية 4. وأوضح ان هذا التحليل وجه فهمنا من سلالة من الخلايا الجذعية العصبية في أدمغة الأجنة والبالغين على أنها تتكون من خلايا ذات النهايات قمية على سطح البطين وعمليات الاتصال القاعدية مكانة الأوعية الدموية. كان من المستحيل تقريبا هذه النتائج باستخدام تقنيات sectioning الكلاسيكية. Wholemounts تسهل أيضا تحديد الخلايا الجذعية العصبية عبر عملية الاتصال بهم ، البطين القمي. كما تم العثور على علامات أكثر تحديدا لهذه الخلايا الجذعية ، وسوف wholemounts تكون جزءا لا يتجزأ من تحديد وتحليل سلوك الخلايا الجذعية العصبية.

Wholemounts من جدران البطين الجانبي أيضا تقديم وجهة نظر مثالية لدراسة الاستقطاب مستو من خلايا البطانة العصبية. خلايا البطانة العصبية هي خلايا بطانة multiciliated البطينين التي تعمل لدفع CSF بطريقة منسقة. مع تقنية wholemount ، يتعرض للظهارة كامل البطانة العصبية ان وجه ويمكن الملون ودراستها بشكل شامل من الأمامي إلى الخلفي حدود بطني وظهري ل. علاوة على ذلك ، تدفق المقايسات البطانة العصبية التي أجريت على تشريح حاد ، wholemounts يعيش تثبت بقوة تدفق مستو الاستقطاب التي تم إنشاؤها بواسطة أهداب البطانة العصبية. وقد كشفت مؤخرا باستخدام نهج العمل wholemount المحددات الخلوية من هذه الاقطاب مستو البطانة العصبية 5. ومن المثير للاهتمام ، واقترحت دراسات wholemount أيضا أن البطانة العصبية ولدت CSF تدفق يؤسس التدرجات chemorepellents التي توجه من هجرة الشباب في الخلايا العصبية SVZ 7. النهوج التي حددت في البداية Wholemount شبكة سلاسل العصبية المهاجرة مستمرة ولذلك لتوفير نظرة ثاقبة الآليات التي تنظم الهجرة السلسلة.

تحليل VZ وSVZ بواسطة التصوير wholemount يضيف أسلوبا جديدا للدراسات المستقبلية على حد سواء وسيلة لتوضيح فهمنا من الدراسات الموجودة. على سبيل المثال ، اقترحت دراسة حديثة أن الخلايا الجذعية العصبية في SVZ الكبار كانوا CD133 + / CD24 خلايا في اتصال مع ال 8 البطين. استنادا immunostaining في الفروع ، وادعى هؤلاء الكتاب أن هذه الخلايا كانت خلايا البطانة العصبية subpopulation multiciliated. ومع ذلك ، في دراستنا باستخدام النهج wholemount ، الذي يعطي نظرة أكثر شمولا من الظهارة والبطانة العصبية كله ، وجدنا أن جميع خلايا البطانة العصبية التعبير عن CD24 والوحيد البطين - الاتصال الخلايا التي تم CD133 + / CD24 - كانت مجموعة فرعية من B1 اكتب 4 خلايا. وعلاوة على ذلك ، فإن تقنية wholemount وعود ليكون من المفيد النظر في الدراسات المستقبلية للمنظمة الفسيفساء وصف مؤخرا من الخلايا الجذعية العصبية في المخ البالغ 9. وقد أظهرت عدة دراسات أن الخلايا الجذعية العصبية في الدماغ لدى البالغين ليست متجانسة من السكان ، ولكن يتم تحديد إقليميا وتنتج عادة فرعية معينة فقط من interneurons البصلة الشمية. وقد اقترحت هذه الدراسات التي قد تكون حاليا مجموعات سكانية فرعية مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية إما عن طريق التعبير عن عوامل النسخ 10،11،12،13،14 محددة و / أو عن طريق التوطين على المستوى الإقليمي على امتداد نطاقات الظهري الأمامي والخلفي بطني والعشرين لل جدار جانبي 9،15،16. كما يتم تحديد العلامات الجزيئية للمزيد من مجموعات سكانية فرعية محددة إقليميا الكبار الخلايا الجذعية العصبية ، وينبغي أن التصوير wholemount توفير رؤية شاملة للparcelation السلف من هذه المجالات المختلفة على طول الجدار البطيني.

ويمكن أيضا تشريح wholemount وتقنيات التصوير المقدمة هنا يمكن استخدامها لتحليل جدران البطين في الجنين. يتم إجراء تشريح للجدار الجانبي الجنينية ، خطوة بخطوة ، وذلك بالطريقة نفسها. هناك اختلافات طفيفة في مستوى الصعوبة ، والبطينين الجنينية هي أكبر نسبيا مما يجعل تشريح أسهل ، ولكن ليونة الأنسجة مما يجعل التلاعب أكثر صعوبة. على وجه الخصوص ، يمكن استخدام التعرض مماثلة للبطين الوحشي في جنينالسراج لتشريح الجدار القشرية من البطين لدراسة الخلايا العصبية القشرية. الأدلة الأخيرة تشير إلى أن الإرث غير المتماثلة الجسيم المركزي يحافظ الدبقية شعاعي على سطح الخلايا العصبية خلال البطين القشرية 17. EN قد وجه التصوير الشعاعي من السطوح قمية الدبقية تقديم رؤى في كيفية موروثة غير متماثلة centrosomes داخل هذه الخلايا الانقسام.

كما هو الحال مع معظم التقنيات ، لا سيما تلك التي تنطوي على مهارة دقيقة ، ويتطلب ممارسة السيادة. هناك ، ومع ذلك ، فإن بعض العناصر في التشريح التي هي مفتاح لأفضل النتائج : 1) ضبط الإضاءة إضاءة العينة لخلق الظلال ويوفر على النقيض لا تقدر بثمن أثناء تشريح الأنسجة التي هي على خلاف ذلك متجانسة نسبيا ، 2) استخدام مثل ملقط يتم استخدامها أبدا اثنين من المسامير الحشرات الملقط في هذا الأسلوب لقرصة معا أو التقاط الأنسجة ، ولكن يتم استخدام الدبابيس والمناورة التي يمكن إعادة تعديل باستمرار لتحقيق الاستقرار في الأنسجة أثناء القص و3) توازن في تراجع لطيف وقطع السكين لا ينبغي إلا أن تستخدم لخفض بل أيضا لتوفير تراجع لطيف لفصل الجدران الإنسي والجانبية ، وتذكر أن تتم في الواقع معظم هذا التراجع من خلال تشريح لطيف مع قطع فقط على فترات متقطعة.

Acknowledgments

العمل بدعم من منحة المعاهد الوطنية للصحة HD - 32116 ، ودعم مؤسسة الأسرة ساندلر ، والخلية الجذعية الصندوق جون باوز ، وزارة التربية ، MHLW وHFSP. ZM بدعم من مؤسسة Baldoceda كارلوس وUCSF زمالة Krevans. AA - B. يحمل هيذر وميلاني مدارس مانشستر يونايتد الرئيس هبوا.

References

  1. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).
  2. Shen, Q. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  3. Tavazoie, M. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).
  4. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  5. Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).
  6. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).
  7. Sawamoto, K. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science. 311, 629-632 (2006).
  8. Coskun, V. CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).
  9. Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain. Science. 317, 381-384 (2007).
  10. Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb. J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).
  11. Waclaw, R. R. The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons. Neuron. 49, 503-516 (2006).
  12. Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).
  13. Kohwi, M. A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors. J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).
  14. Hack, M. A. Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis. Nat Neurosci. (2005).
  15. Ventura, R. E., Goldman, J. E. Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain. J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).
  16. Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns. PLoS Biol. 5, e300 (2007).
  17. Wang, X. Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors. Nature. 461, 947-955 (2009).
المنطقة Subventricular اون الوجه : يلطخ Wholemount والتدفق البطانة العصبية
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter