Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

En yüze Subventricular Bölge: Wholemount Boyama ve ependim Akış

doi: 10.3791/1938 Published: May 6, 2010

Summary

Lateral ventrikül duvarları en büyük yetişkin memelilerin beyin germinal bölge içerir. Geleneksel olarak, bu bölgedeki nöron çalışmaları klasik histolojik analiz için kesit alma teknikleri dayanıyordu. Burada, bu germinal bölgenin kapsamlı, en-yüz görünümü sağlar wholemount tekniği, alternatif bir yaklaşım sunuyoruz.

Abstract

Lateral ventriküllerin duvarları en büyük yetişkin memelilerin beyin germinal bölge içerir. Bu duvarlar subventricular bölgesi (SVZ), davranış ve sinir kök hücrelerinin, yetişkin nöron düzenlenmesi anlamak için yoğun çalışılan bir model sistem. Geleneksel olarak, bu çalışmalar, histolojik analizi için klasik kesit teknikleri konusunda yararlanmıştır. Burada, bu germinal bölgenin kapsamlı, en-yüz görünümü sağlar wholemount tekniği, alternatif bir yaklaşım sunuyoruz. Bölümlerini, wholemounts SVZ içinde, tam hücre mimarisini ve hücresel ilişkileri korumak. Bu yaklaşım son zamanlarda yetişkin sinir kök hücreleri, ya da tip B1 hücreleri, lateral ventriküller astar farklılaştırılmış ependim hücreleri ile karışık bir neuroepithelium parçası olduğunu ortaya koymuştur. Buna ek olarak, bu yaklaşım ventrikül üreten ependim hücreleri ve beyin omurilik sıvısı akış düzlemsel kutuplaşma incelemek için kullanılır olmuştur. Yetişkin sinir kök hücrelerinin bölgesel belirtilen heterojen bir nüfus olduğunu son kanıtlar, wholemount yaklaşım muhtemelen bu kök hücre nişinin organizasyon ve Parselasyon anlamak için önemli bir araç olacaktır.

Protocol

I. ependim Akış Testi (sadece boyama amaçlı wholemounts hazırlarken eğer şu adımları atlanabilir) Floresan mikro dolu Cam mikropipetler hazırlanması.

  1. Wiretrol 5 ul cam kapiller tüp cam mikropipet çektirmesi üzerine Güvenli ve pürüzsüz, sığ konik pipet çekmek için, ısıtıcı ve solenoid ayarlarını.
  2. Pozitif hava basıncı bir kaynak çekti mikropipet ucuna takın ve 45 ° açıyla, bir metal ızgarası yüzeye pipet ucu hafifçe daha düşük eğimli bir ipucu oluşturmak. Pozitif hava basıncı cam pipetin içinde enkaz temizlemek için yardımcı olur. Etanol-nemlendirilmiş doku ile kesik ucunun sonunda temizleyin.
  3. Pipet ucu bir mikrometre ile mikroskop altında inceleyin. Ucu ~ 100 um bir iç açılış çapı ile pürüzsüz bir konik olmalıdır. Daha küçük çapları kullanılır ama genellikle floresan boncuklar ile pipet tıkanması sonucu olabilir.
  4. Mineral yağ ile dolgu pipet yarım dolana kadar, sonra pipetin içine yağ daldırma pistonu geri takın. Mineral yağ, piston elle iterek pipet Avans menisküs.
  5. Güvenli bir micromanipulator üzerine mikropipet ve piston, daha sonra küçük bir sabit kolu üzerinde yüksekliği ayarlanabilir mikromanipülatör pipet tutucu vida.
  6. Frontload% 50 floresan microbead stok solüsyonu,% 45 su ve% 5 gliserol oluşan floresan microbead çözüm, pipet. Gliserol wholemount üzerine yatırılır yüzeye mikro-lavabo, böylece çözümün yoğunluğunu artırmak için eklenir.
  7. Güvenli bir yerde yanlışlıkla iğne kırılmış ve wholemount diseksiyon devam etmeyecektir mikromanipülatör yerleştirin.

II. Wholemount Diseksiyon ve Fiksasyon

  1. 37 L-15 Leibovitz medya wholemount diseksiyon için hazırlamak için, sıcak yeterli miktarda ° C. Incelemek için hayvan başına yaklaşık 10 ml gerekir. Makas, dişli büyük forseps, düz ince forseps, Sharpoint 22.5 ° mikrocerrahi bıçak bıçak, tabak diseksiyon, kağıt havlu, biyolojik tehlike çanta ve buz üzerinde dolu bir 24 plaka: Ayrıca tüm stereomikroskopta diseksiyon ve sabitleme için gerekli malzemeleri toplamak Triton X-100 ile% 4 veya% 0.1 olmadan paraformaldehid. Triton X-100, bu çözüm çeker wholemount yüzey kesme sıklığı azalır PFA çözümü, yüzey gerilimini azaltmak için kullanılır.
  2. Floresan stereomikroskop altında yerleştirilen bir diseksiyon çanak içine ısıtılmış medya 5-10 ml dökün. Diseksiyon yemekleri iyice kullanmadan önce büyük hacimlerde su yemekleri durulama, 6 cm plastik tabak içine Sylgard 184 adı verilen elastik bir polimer, dökme ve vakum altında 1 hafta polimer çözüm çare izin hazırlanmıştır. Genellikle yemekler 1 hafta, 1 L beher su ile ıslatın sağlar.
  3. Hayvan servikal dislokasyon ile sakrifiye ve kafasını kesti.
    Not: İstenirse, hayvanın normal serum fizyolojik ile perfüze önce beyin dışarı Anatomi kan damar temizlenmiş olabilir. Diaminobenzidin kromojenik immün (DAB) yerine, bu özellikle önemlidir.
  4. Bir kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi boyunca orta hat insizyonu, anterior posterior yapılır.
  5. Kafatası kafatası 4 kesim bir dizi açmak için yapılır: bir kesim önümüzdeki iki keser, beyincik aşağı ve kafa tabanı kafatası ayrı ve Final Cut çalıştırır, koku ampuller ön iki yörüngeleri yayılıyorsa mid-sagital sütür boyunca anterior posterior.
  6. Kafatası flep nazikçe geri çekilir ve beyin diseksiyon çanak çıkartılmakta ve yerleştirilir.
  7. Diseksiyon kalanı stereomicroscope altında yapılır. İlk olarak, beynin koku alma ampuller uzakta diseke. Koku ampuller incelemek için ek isterseniz, sadece bir gecede% 4 PFA daldırma bunları düzeltmek ve daha sonra kesit ve boyama için onları hazırlamak olabilir.
  8. Interhemisferik fissür boyunca beyin Böl.
  9. Koronal odaklı bir kesim, daha sonra kaudal hipokampus kesit görüntülenebilmekte izin, arka-en-boy interhemisferik fissür yapılır.
  10. Bu pozisyonda lateral ventrikül medial duvar formları hipokampus, daha sonra ventrikülün dorsal lateral duvar formları örten korteks, serbest olmalıdır. Birincisi, bıçak, korteks ve dorsal hipokampus arasındaki küçük ventrikül uzaya eklenir ve bir kesim hipokampus katılmak için, orta hatta uzak, ventral yansıtan korteks yapılır. Bu kesim yapıldıktan sonra, yavaş yavaş, ventral dorsalden hareketli lateral ventrikül ortaya çıkarmak için, hipokampus, korteks uzak soyulmuş olabilir. Bu manevrakorteks, hipokampus yayımlanan köşesinde bir kama keserek hızlandırılmış. Bu pozisyonda lateral ventrikül ventral en dereceye ulaştıktan sonra, ya hipokampus katılmak için geri mediale görselleştirmek veya korteks tekrar etrafında dolanıyor hissediyorum, bu süre yansıtan. Başka bir kesim tamamen hipokampus veya medial duvar korteksin veya lateral ventrikül lateral duvarında lateral ventrikül serbest bırakmak için bu pozisyonda yapılmalıdır.
  11. Daha sonra yaygın olarak lateral ventrikül açmak için mediale ve anteriora hipokampus, korteks uzak çekmek için kolay olacaktır.
  12. Anteriora medial ve yan duvarları dışında geri çekmek için küçük forseps ve bıçak darbeleri kullanarak hipokampus yavaşça çekmeye devam edin.
  13. Bu geri çekme direncini artırmak için başladıktan sonra, ek kesikler ihtiyaç vardır. İlk olarak, lateral ventrikül maruz kalma artırmak ve özellikle, lateral duvar ve SVZ, korteks uzak teşrih. Korteks temiz korpus kallosum ve VZ / SVZ arasındaki arayüz görüntülenmesi disseke edilir. Sadece SVZ zarar görmesini önlemek için kallozal tarafında kalan bu arayüz boyunca kesilmiş.
  14. Lateral duvar uzak geri çekilmeden medial duvar devam etmek için, iki kesimler daha fazla ihtiyaç vardır: lateral duvar, medial duvar ve korteks olduğu her yerde bir dorsal kesim, ve bir ventral kesme duvarı, medial duvar ve talamus yakınlaşıyor. Bu kesimler ile, medial duvarda daha nazik retraksiyonu lateral ventrikül anterior en ölçüde açılmasına olanak tanır.
  15. Doğru aydınlatma prosedürü boyunca ve özellikle medial ve yan duvarları anteriora ayrılır sonraki adımda esastır. Bu lateral ventrikül anterior pozisyonda, medial duvar geri yansıtır ve lateral duvar ile sürekli. Yansıma noktası, iki duvar arasında bir vadi gibi görünen bu iki duvar arasında gölge ortaya böyle aydınlatma ayarlayın. Bu iki duvar ayırmak için bu vadinin tam olarak kesin.
  16. Son olarak, tamamen, ventral dorsal herhangi bir sarkan korteks ve talamus kaldırarak lateral duvar maruz kalmaktadır.
  17. Wholemounts immün için hazırlanırken, 4 Triton-X100 ile veya% 0.1 'olmadan bir gece fiksasyon için% 4 PFA ile dolu bir 24 plaka ° C dikkatlice diseksiyonu çanak wholemount, ventrikül yan aktarırsanız Fiksasyon duyarlı antijenler için, wholemounts kısa süre için sabit olabilir. Sonra immün wholemounts bölüm 4 geçin.
  18. Wholemounts ependim akış analizi için hazırlanması, taze, 37 ° C Leibovitz orta dolu temiz bir diseksiyon çanak wholemount aktarmak ve bir sonraki bölüme geçin.

III. Floresan mikro kullanarak ependim Akış Analizi

  1. 2 böcek iğne, talamus ve wholemount dorsal anterior-köşe kullanarak temiz bir diseksiyon çanak wholemount hareketsiz.
  2. Stereomikroskopta yanında mikromanipülatör tutan sabit kol tabanına yerleştirin. Ayarlanabilir kol yüksekliği maksimum diseksiyon çanak karşı iğne kırılması önlemek için yükselir emin olun.
  3. Dikkatlice dış ucunda iğne olan mikro temizlemek için bir ependorf tüp içinde medya iğne ucu batırın. Bunlar hemen temizleniyor değilse, bunlar sonradan iğne konumlandırma sırasında yanlışlıkla wholemout yüzey üzerine yatırılır ve filmin genel kalitesini düşürür olabilir.
  4. Lateral duvar dorsal yüzey üzerinde iğne ucu yerleştirin ve orta içine iğne ucu getirmek için kol düşük. İğne sadece lateral duvar yüzeyi üzerinde olduğu kadar düşürülmelidir.
  5. Pozisyonda bir iğne ile, zoom yapın ve istediğiniz bir alanı kapsayacak şekilde stereomikroskopta odaklanmak. Ependim akışının bir kayıt olacaksa, şu anda görüntü almak başlar.
  6. Wholemount yüzeye microbead çözüm ~ 5 nl Çıkar. Boncuk başlangıç ​​bolus ependim akış yüzey temizlenir olmuştur, boncuk ejeksiyon ek tur yapılabilir.

IV. Immün Wholemounts

  1. Immün için disseke Wholemounts 4 ° C'de% 0,1 Triton-X100 olmadan% 4 PFA gecede daldırma sabit Triton-X100 kullanımı tedaviyi tolere antijenler için tercih edilir, ancak deterjan ile boyama kalitesi azalmış olduğu durumlarda bırakılabilir.
  2. Ertesi sabah, PFA 24 plaka aspire edilir ve wholemounts, her biri için 5 dakika, ya da% 0,1 Triton-X100 olmadan 0,1 M PBS 3 kez yıkanır. Daha önce olduğu gibi, bu protokoldeki tüm yıkar Triton-X100, tercih edilen, ancak gerekli değildir. Bu protokol boyunca, tüm üzerinden çözümler alışverişimontaj iyi tarafı çözüm dikkatli aspirasyon gerektirir. Sonra, iyi wholemount üzerine de, doğrudan tarafı üzerinde çözüm yıkar gibi açılı bir transfer pipet kullanarak solüsyonu ile doldurulur. Her zaman yukarı bakacak şekilde wholemount ventrikül tarafında tutmak için özen gösterin. Güçlü pipetleme çözümler genellikle wholemount çevirmek olacaktır. Biz doku kurumasını önlemek için bir defada 1 wholemount üzerinden çözümler alışverişi için tercih ediyor.
  3. PFA yıkadıktan sonra, wholemounts Triton-X100 ya da 0,1 M PBS içinde% 10 normal bir keçi ya da eşek serum içeren çözümü engelleme, oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Triton-X100 boyama kullanıyorsanız, engelleme çözümü% 2 veya% 0.5 Triton-X100 olarak kullanmayı tercih edebilirler. SVZ bulunan bu antijen olarak doku derinliklerine antikor penetrasyon gerektiren antijenleri için boyama yaparken% 2 Triton-X100 kullanın. Ancak, ependim hücrelerinin apikal yüzeyinde bulunan antijenler gibi lateral duvar, yüzeye yakın bulunan antijenler için boyama,% 0.5 'lik Triton-X100 kullanın. Buna ek olarak, hücre yüzeyi veya deterjan tarafından kaldırılamaz veya değiştirilemez diğer antijenler için Triton-X100 bırakılmalıdır.
  4. Sonra, engelleme çözüm kaldırmak ve aynı engelleme çözümü seyreltilmiş primer antikor ve 4 24 ya da 48 saat süreyle inkübe ° C Kuluçka dönemi seçimi,% 0,5 veya% 2 Triton seçimi benzer antijen bağlıdır. Wholemount yüzeyinde bulunan antijenler, 24 saat inkübasyon yeterli. Ancak, daha derin, bu SVZ bulunan antijenler için, 48 saatlik inkübasyon süreleri daha iyi sonuçlar sağlar.
    Örneğin, lateral ventrikül duvarını kaplayan hücrelerin apikal yüzey ve bazal organlar çalışma, hücre zarı etiket, β-katenin karşı antikorlar leke ve γ-tubulin, bazal organları etiket. 0,1 M PBS% 10 normal keçi serumu ve% 0.5 Triton-X100 içeren fare anti-β-katenin antikorları (1:500) ve tavşan anti-γ-tubulin antikor (1:1000) sulandırınız. 4 ° C de 24 saat inkübe edin.
    Yetişkin sinir kök hücreleri, ya da tip B1 hücreleri leke, GFAP antikor ile lateral duvar leke
    . 0,1 M PBS% 10 normal keçi serumu ve% 2 Triton-X100 içeren fare anti-GFAP antikorlar (1:500) sulandırınız. 4 ° C'de 48 saat inkübe edin.
  5. Birincil antikorlar PBS içinde% 0,1 Triton-X100 ile veya olmadan başlangıçta 2 hızlı durular yıkanır. Ardından her biri 20 dakika oda sıcaklığında 3 ek yıkar.
  6. Primer antikorları için kullanılan aynı engelleme çözüm ikincil antikorlar seyreltilir ve zaman aynı uzunlukta 4 primer antikor olarak inkübe wholemounts eklemek ° C
    Örneğin, β-katenin ve γ-tubulin boyama: (1:400, Alexa Fluor 488 keçi anti-fare antikorları (anti-β-katenin, 1:400 fare tanır) ve Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan antikorları sulandırmak % 10 normal keçi serumu ve% 0.5 Triton-X100 içeren 0,1 M PBS Rabbit anti-γ-tubulin) tanır. 4 ° C de 24 saat inkübe edin.
    GFAP immün: seyreltik Alexa Fluor 488 keçi anti-fare antikorları% 10 normal keçi serumu ve% 2 Triton-X100 içeren 0,1 M PBS (1:400, fare anti-GFAP tanır). 4 ° C'de 48 saat inkübe edin.
  7. Sekonder antikorlar, primer antikorları için yapılan aynı yıkar kullanarak wholemount yıkanır.
  8. İsterseniz, nükleer sayacı-boyama, oda sıcaklığında 30 dakika ve daha sonra PBS içinde bir kez yıkama PBS içinde seyreltilmesi DAPI kuluçka bu noktada yapılabilir.

V. Konfokal Mikroskop Slaytlar üzerine Montaj ile immunohistokimyasal Wholemounts

  1. Yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme, doku 200-300 um kalın bir şerit olarak sadece lateral ventrikül lateral duvar korumak için alt disseke gereken wholemounts immün şu. Altta yatan striatum lateral duvar ayırmak, bir slayt üzerine monte edilmiş ve düz bir şekilde bir lamel ile kaplı sağlar.
  2. Ince düz forseps, Sharpoint 22.5 ° mikrocerrahi bıçak bıçak, diseksiyon çanak, mikroskop slaytlar ve lamelleri, 0.1 M PBS ve Aquamount montaj orta ile immunohistokimyasal wholemounts ve aşağıdaki alet ve ekipman ile stereomikroskopta dön.
  3. 24 plaka 0,1 M PBS ventrikül tarafında tutmak için dikkatli olmak içeren diseksiyon çanak wholemount aktarın.
  4. Birincisi, tamamen korpus kallosum lateral duvar karşılayan hattı boyunca tam keserek wholemount dorsal anterior posterior korteks kaldırmak. Bu kallozal beyaz madde ve pembe görünmesini SVZ arasında arayüz olarak kabul edilmektedir.
  5. Sonra wholemount ventral genelinde uzun bir yatay odaklı bir kesim olun. Bu kesim yüzeyinin size st hangi üzerine bir platform sağlayacaktırdiseksiyonu bir sonraki adımı sırasında wholemount abilize.
  6. Yukarı bakacak şekilde wholemount dorsal yüzeyi ile, lateral duvar boyunca posterior anterior SVZ kalınlığı görselleştirmek mümkün olacaktır. Bu görüşe temel striatum ve SVZ görülebilir izin korteksin ilk kaldırma ile mümkün olduğunu unutmayın. SVZ ventrikül yüzeyinden striatum uzanan doku ince bir bant olarak tanımlanır. SVZ striatum beyaz cevher sicimler tarafından infiltre ise homojen bir pembe bir görünüme sahiptir. SVZ anteriora kalın ve posteriora kademeli olarak incelir.
  7. SVZ ve striatum arayüzü belirledik, dikkatle, lateral duvar ön-en-boy kesim bu arayüz dorsalden ventral bıçak ilerleyen başlar. Doğru Bunu yapmak için, iki iğne olarak kullanılan forseps ile wholemount stabilize edilir. Ayrıca dorsal ventral lateral duvar boyunca ilerleyen bıçak hafifçe görselleştirmek için wholemount açmak için forseps kullanabilir. Bu diseksiyon doku şerit çok düz olması için. Bu lateral duvar arasında posterior anterior SVZ dilim olarak, yaptığınız kesim yönünü her zaman ventrikül yüzeyine paralel olarak kalması gerektiğini anlamına gelir.
  8. Daha posteriora unutmayın SVZ incelir. Aksine bu noktada sadece SVZ kesmek için diseksiyon inceltme daha posteriora peşin olarak disseke doku kalınlığı aynı kalır önemlidir. Bu sonradan monte doku şerit düz olmasını sağlayacaktır.
  9. Altta yatan striatum lateral duvar tamamen ayırdıktan sonra, diğer tüm çevre dokulara ventriküler duvar parçası değildir, bu şerit dikkatlice çıkarın.
  10. Sonra aşağıya forseps kullanarak bu şerit pick up ve bir mikroskop lamı merkezi konumu. Wholemount doğrudan aquamount birkaç damla uygulayın ve hafifçe doku yüzeyine kabarcıklar tanıtmak için çalışıyoruz, bunun üzerine merkezli bir lamel yerleştirin. Slayt ağırlığı eşit aquamount dağılır sağlayacak ve lateral duvar yüzeyine rafine bir düzleşme üretecek. Aquamount miktarı kullanılan ve lamel boyutunu disseke doku yaşına bağlıdır. Embriyonik ve erken doğum sonrası dokular için, biz aquamount 1 damla ve 22 "x 30" lamel tercih ediyor. Konfokal lazerler lamel ve doku yüzeyi arasında aquamount ikamet eden ince bir tabaka daha az nüfuz mümkün olacak çünkü daha ağır lamelleri doku deforme olabilir ve görüntü kalitesi ile daha aquamount engel olacaktır. Daha sonra doğum sonrası ve yetişkin dokular için, biz aquamount 4 damla ve 24 "x 60" lamel kullanın.
  11. Slaytlar daha sonra 4 ° C'de 1-2 gün önce görüntüleme için lamelleri yerleşmek için izin slayt kitap düz saklanır.

Temsilcisi Sonuçlar

Wholemount yaklaşımlar yetişkin SVZ germinal faaliyet içine birkaç temel anlayışlar sağladı. SVZ genç nöronların göç zincirleri ağ ilk polysialylated nöral hücre adezyon molekülü (PSA-NCAM 1) karşı antikorlar ile boyanmış lateral ventrikül lateral duvar wholemounts sonra gözlendi. Bu zincirleri göç neuroblasts wholemounts doublecortin antikorlar (Şekil 1) ile immün sonra da görülebilir. Dikkate değer zincirlerinin ağ üzerinde dorsal çalışan bir yapışma noktası etrafında ventral çalışan bir hücre iki genel akarsuları, kalıplaşmış bir modeli vardır. SVZ Wholemounts Ki67 boyama Şekil 2'de de görüldüğü gibi, bu bölgede progenitörlerin proliferatif aktivite kapsamlı bir görünüm sağlar. İlginçtir ki, iki yeni çalışmalar SVZ hücrelerin bölünmesi ve yerel vasküler 2,3 (Şekil 2) arasında yakın bir etkileşim öneririz.

Yüksek güç konfokal mikroskobu altında incelendiğinde, wholemounts tarafından sağlanan en yüz görünümü, ventriküler sistemi döşeyen hücrelerin apikal yüzey benzersiz bir bakış açısı sağlar. Bu en-face açısından son SVZ tip B1 hücreleri, yetişkin nöral kök hücreler, olmayan bölünmesi farklılaştırılmış ependimal hücreler 4 ile karışık bir neuroepithelium parçası olduğunu ortaya koymuştur. B1 türü hücrelerin temas lateral ventrikül apikal yüzey ve fırıldak yapılandırmasında büyük ependim hücrelerin apikal yüzeyleri ile çevrilidir (Şekil 3, oklar B1 apikal yüzeyleri gösterir). Ayrıca, yakın muayene ependim hücrelerinin apikal yüzeyinde translasyonel konumu ve dönme yönünü kendi bazal cisimlerin düzlemsel polarite 5 göstergeleri olduğunu ortaya koymuştur. Ependim hücre bazal boölür apikal yüzeyinde bir yama kümelenmiş. Bu yama BOS akım (translasyon polarite) saygı ile downstream "yönünde apikal yüzey merkezinde yer değiştiren bu yama içinde, her bazal vücut uzun ekseni etrafında döndürülür, bazal ayak, bazal bir aksesuar gövde, akış yönü (dönme polarite) puan Komşu ependimal hücreler aynı yönde odaklı bazal organları var. önemlisi, ependim akış testinin videomicrographs lateral duvarının belirli bir bölgedeki akış doğrudan karşılaştırmak için kullanılır. yönünü bu bölgede ependim bazal hücre organları (Şekil 4).

Yüksek güç görüntüleme, yetişkin beyin germinal bölgenin en büyük panoramik bir bakış açısı sağlayan ek olarak, wholemounts SVZ bireysel hücre morfolojileri daha eksiksiz ve ayrıntılı bir analiz izin verir. Wholemounts GFAP immün Yüksek güç konfokal görüntüleme ortaya koyduğu bu tip B1 hücrelerinin yanı sıra, kısa ventrikül apikal süreci temas, kan damarları (Şekil 5) 4 ile temas halinde, uzun bir bazal süreç var . Bu hücre mimarisini bazal süreci çoğunlukla ventriküler duvara paralel çalıştığı için koronal bölümleri önceden takdir edilmiştir yoktu. Seri kesit bu nedenle bir hücrenin tam morfoloji yeniden neredeyse imkansız, ya da diğer hücre türlerine SVZ ilişkiyi anlamak için, küçük parçalara tek tek hücrelerin keser. Wholemount yaklaşım, panoramik manzarasına sahip olan düşük güç mikroskopi ve yüksek güç mikroskobu ile tek tek hücrelerin tam bir perspektif sağlayarak hem klasik kesit alma teknikleri üzerinde birçok avantajı vardır. Bu teknik, bu yetişkin beyin germinal bölge gelecek çalışmalar için önemli bir tamamlayıcı olmaya devam edecektir.

Şekil 1
Şekil 1 SVZ göçmen nöron zincirleri Ağ. Çinili konfokal görüntüleri lateral duvar wholemount yeniden SVZ boyunca göç neuroblasts etiketler doublecortin karşı antikor ile boyandı. Göç iki yıldız (*) ile belirtilen genel akışları üzerinde dorsal çalışan bir yapışma noktası etrafında ventral çalışan vardır. Oklar anterior (a) ve dorsal (d) yönden göstermektedir. Ölçeği bar = 1 mm.

Şekil 2
Şekil 2 SVZ damarsal ve bölünen hücreleri arasındaki ilişki. Bu lateral duvar wholemount kırmızı damar etiket fare immünoglobulinler karşı bölen yeşil hücreleri ve antikorlar etiket, Ki67 antikorları ile boyanmış. Bu wholemount boyamadan önce serum fizyolojik ile perfüze değildi, çünkü endojen fare IgG molekülleri kan damarları içinde kalır ve ikincil anti-fare antikorları ile boyanan. Yeni iş bölünerek SVZ öncüleri (yeşil), kan damarları yakın (kırmızı) {Shen, 2008 # 6523} {Tavazoie, 2008 # 6522} bulunmaktadır önerir. Oklar anterior (a) ve dorsal (d) yönden göstermektedir. Ölçeği bar = 1 mm.

Şekil 3
Şekil 3. ventrikül lateral duvara temas hücrelerinin apikal yüzeyinde. Bir wholemount Yüksek güç konfokal görüntü, β-katenin hücre zarları yeşil etiket immunohistokimyasal, ve kırmızı bazal organları etiket γ-tubulin, bu epitel hücrelerinin düzlemsel bir organizasyon ortaya koymaktadır. Tip B1 hücreleri, yetişkin nöral kök hücreler, oklarla gösterilen tek bir bazal vücut küçük bir apikal yüzey var. Bu hücrelerin apikal yüzeyinde büyük bir fırıldak yapılandırma ependim hücrelerinin apikal yüzey tarafından çevrilidir. Ependim hücrelerinin apikal yüzeyinde çok sayıda bazal cisimlerin konumu ile gösterilen düzlemsel polarite var. Komşu ependimal hücreler, BOS akım {Mirzadeh, 2010 # 6573} yönüne karşılık apikal yüzeyinin aynı tarafında (aşağı ve sola bu bölgede) bulunan bazal vücut kümeleri, var. Ölçek çubuğu = 10 mm.

Şekil 4
Şekil 4 ependim akış tahlil. Kompozit görüntü ependim akışı tahlil sırasında çekilmiş bir film 100 peş peşe birleştirerek oluşturulan. Floresan mikro Monroe foramen doğru, dorsal ve posterior yapışma alanında iki odaklı akarsu, üzerinde ve altında bir yapışma ependim kirpikler tarafından tahrikli yatırılır. Bu odaklı akış ependimal hücreler işlevsel düzlemsel polarite ortaya koymaktadır. Her akış hattı, zaman içinde üst üste noktalarında tek bir boncuk konumunu gösteriyor. Ölçeği bar = 0.5 mm.


Şekil 5 GFAP + tip B1 hücreleri kan damarları üzerinde son ayağı ile uzun bir bazal fiber var. Lateral duvar wholemount alınan yüksek güç konfokal yığını maksimum projeksiyon SVZ astrositler etiket GFAP antikorlar ile boyanmış. Bu boyama etiket yetişkin sinir kök hücreleri, ya da tip B1 hücreleri, apikal ventriküler yüzeyinde bir bitiş ve burada gösterildiği gibi, uzun bir GFAP + kan damarları (oklar) biter bazal lif. Kan damarları, ikincil antikor fare anti-GFAP antikorlar damar içinde endojen fare IgG farkındayız görselleştirmek için kullanılır, çünkü burada lekeli. Ölçek çubuğu = 50 mm.

Discussion

Ventrikül ve subventricular bölgelerde nöron çalışmaların çoğu bu bölgelerde mikroanatomisinin ve hücresel ilişkileri incelemek için klasik kesit alma teknikleri dayanıyordu. Burada sonra anti-mitotik tedavi 6 ve en son kesin apikal çalışma için kullanılan aşağıdaki SVZ progenitör nüfusun yenilenme incelemek için kullanılan ilk SVZ 1 neuroblasts göçmen zincirleri ağ analiz etmek için kullanılan alternatif bir yöntemdir, tarif ve yetişkin SVZ sinir kök hücreleri 2,3,4 bazal hücre-hücre etkileşimleri. İlginçtir ki, bu tekniğin yetişkin SVZ sinir kök hücreleri, ya da tip B1 hücreleri, farklılaştırılmış olmayan bölünmesi ependimal hücreler ile karışık bir neuroepithelium parçası olduğunu ortaya koymuştur. En yüze görüntüleme wholemounts kullanarak bu karışık neuroepithelium ependimal hücreler 4 büyük apikal yüzeyleri ile çevrili tip B1 hücrelerinin apikal sonlar oluşan fırıldak mimarisi olduğunu göstermiştir. Bu tr-yüz analizi hücreleri vasküler bir niş iletişime ventrikül yüzeyinde apikal sonlar ve bazal süreçleri ile oluşan embriyonik ve yetişkin beyinlerinde sinir kök hücrelerinin köken anlayışımıza açıklık vardır. Bu bulgular klasik kesit alma teknikleri kullanarak, neredeyse imkansız olurdu. Wholemounts da ventrikül temas apikal süreci ile nöral kök hücrelerin belirlenmesini kolaylaştıracaktır. Bu kök hücreler için daha spesifik belirteçler olarak, wholemounts sinir kök hücre davranışının belirlenmesi ve analiz ayrılmaz bir parçası olacaktır.

Lateral ventrikül duvarları Wholemounts ependimal hücreler düzlemsel polarite çalışmak için ideal bir perspektif sağlamaktadır. Ependimal hücreler koordineli bir şekilde BOS itmek işlevi ventriküller astar multiciliated hücrelerdir. Wholemount tekniği ile, tüm ependim epiteli en-face maruz kalmaktadır ve posterior ve dorsal ventral sınırları boyanmış ve onun anterior kapsamlı incelenebilir. Ayrıca, ependim akış testleri akut disseke, canlı wholemounts sağlam ependim kirpikler tarafından oluşturulan düzlemsel polarize akış göstermektedir. Son çalışmalar wholemount yaklaşımları kullanarak bu ependim düzlemsel polarite 5 hücresel belirleyicileri ortaya çıkardı. İlginçtir ki, wholemount çalışmalar da ependim oluşturulan BOS akım SVZ 7 genç nöronların göç kılavuzu chemorepellents gradyanlar kurar düşündürmektedir. Bu nedenle başlangıçta göçmen nöron zincirleri ağ tespit Wholemount yaklaşımlar zinciri göç düzenleyen mekanizmalar açılımlar sağlamaya devam etmektedir.

Wholemount görüntüleme VZ ve SVZ Analizi, hem de gelecekteki çalışmaları ve mevcut çalışmaları anlayışımız açıklığa kavuşturmak için bir yol için yeni bir yaklaşım ekliyor. Örneğin, yeni bir çalışmada, yetişkin SVZ nöral kök hücreler ventrikül 8 ile temas CD133 + / CD24-hücreler olduğunu düşündürmektedir . Bölümlerde kendi immün dayanarak, bu yazarların bu hücrelerin bir ICSI'nin multiciliated ependimal hücreler olduğunu iddia etti. Ancak, bizim çalışmamızda tüm ependim epitel daha kapsamlı bir görünüm verir wholemount yaklaşım kullanarak, bulduğu tüm ependimal hücreler ifade CD24 ve tek ventrikül temas B1 tipi bir alt kümesi + / CD24-CD133 hücrelerin hücreleri 4. Ayrıca, wholemount teknikle, yetişkin beyin 9 sinir kök hücrelerinin son açıklanan mozaik organizasyon inceleyerek gelecekteki çalışmalarda faydalı olmayı vaat ediyor . Çeşitli çalışmalar, yetişkin bir insanın beyninin nöral kök hücreler homojen bir nüfus olduğunu göstermiştir, fakat bölgesel belirtilen ve normal koku alma ampul internöronlar yalnızca belirli alt tipleri üretmek. Bu çalışmalar, nöral kök hücrelerin farklı alt popülasyonlar özel transkripsiyon faktörleri 10,11,12,13,14 ve / veya dorsal-ventral ve ön-arka kapsamlarını boyunca bölgesel localisation ifade ayırt edilebilir olduğunu önerdi lateral duvar 9,15,16. Yetişkin nöral kök hücrelerin bölgesel belirtilen alt popülasyonlar daha moleküler belirteçlerin tespit olarak, wholemount görüntüleme ventrikül duvar boyunca bu farklı progenitör etki bölümlenmesi kapsamlı bir bakış vermelidir.

Burada sunulan wholemount diseksiyon ve görüntüleme teknikleri de ventriküler duvarları embriyo analiz etmek için kullanılıyor olabilir. Embriyonik lateral duvar diseksiyonu, adım-adım, aynı şekilde yapılır. Zorluk seviyesinde sadece ufak farklar vardır; embriyonik ventriküller diseksiyonu kolaylaştırır görece daha büyük, ancak doku manipülasyonu daha zor hale yumuşaktır. Özellikle lateral ventrikül benzer bir poz Embry kullanılabiliros kortikal kortikal nöron çalışmada ventrikül duvar incelemek. Son kanıtlar, bu asimetrik centrosome miras kortikal nöron 17 sırasında ventrikül yüzeyinde radyal glia korur göstermektedir . En yüze radyal glial apikal yüzeyleri görüntüleme bu bölünen hücreleri içinde centrosomes asimetrik miras nasıl içgörüler sağlayabilir.

Özellikle en hassas becerisi içeren bu teknikleri, olduğu gibi, ustalık pratik gerektirir. Ancak, daha iyi sonuçlar için anahtar diseksiyonu birkaç elemanları vardır: 1) aydınlatma gölgeler oluşturmak için örnek aydınlatma ayarlama gibi forseps kullanarak), aksi takdirde 2 nispeten homojen doku diseksiyonu sırasında paha biçilmez bir kontrast sağlar birlikte çimdik veya doku almak için kullanılan bu tekniğin iki böcek pimleri forseps asla, ama manevra pimleri dokuyu stabilize etmek için sürekli yeniden olabilir), nazik retraksiyon bir denge 3 kesme ve kesme bıçak olmamalıdır olarak kullanılır sadece kesmek için değil, aynı zamanda bu diseksiyon çoğunluğu aslında sadece aralıklı kesme nazik retraksiyonu ile gerçekleştirilir olduğunu hatırlayarak, medial ve lateral duvarlar ayrı nazik retraksiyon sağlamak için kullanılır.

Acknowledgments

NIH hibe HD-32.116, Sandler Aile Vakfı, John Bowes Kök Hücre Fonu, MEXT, MHLW ve HFSP Yardımcı tarafından desteklenen çalışın. ZM Carlos Baldoceda Vakfı ve UCSF Krevans Bursu tarafından desteklenmektedir. AA-B. Heather ve Melanie donatılmış Başkanı Muss tutar.

References

  1. Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 14895-14900 (1996).
  2. Shen, Q. Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions. Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).
  3. Tavazoie, M. A specialized vascular niche for adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 3, 279-288 (2008).
  4. Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain. Cell Stem Cell. 3, 265-278 (2008).
  5. Mirzadeh, Z., Han, Y. G., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Cilia organize ependymal planar polarity. J Neurosci. 30, 2600-2610 (2010).
  6. Doetsch, F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 11619-11624 (1999).
  7. Sawamoto, K. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain. Science. 311, 629-632 (2006).
  8. Coskun, V. CD133+ neural stem cells in the ependyma of mammalian postnatal forebrain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 1026-1031 (2008).
  9. Merkle, F. T., Mirzadeh, Z., Alvarez-Buylla, A. Mosaic organization of neural stem cells in the adult brain. Science. 317, 381-384 (2007).
  10. Young, K. M., Fogarty, M., Kessaris, N., Richardson, W. D. Subventricular zone stem cells are heterogeneous with respect to their embryonic origins and neurogenic fates in the adult olfactory bulb. J Neurosci. 27, 8286-8296 (2007).
  11. Waclaw, R. R. The zinc finger transcription factor Sp8 regulates the generation and diversity of olfactory bulb interneurons. Neuron. 49, 503-516 (2006).
  12. Kohwi, M., Osumi, N., Rubenstein, J. L., Alvarez-Buylla, A. Pax6 is required for making specific subpopulations of granule and periglomerular neurons in the olfactory bulb. J Neurosci. 25, 6997-7003 (2005).
  13. Kohwi, M. A subpopulation of olfactory bulb GABAergic interneurons is derived from Emx1- and Dlx5/6-expressing progenitors. J Neurosci. 27, 6878-6891 (2007).
  14. Hack, M. A. Neuronal fate determinants of adult olfactory bulb neurogenesis. Nat Neurosci. (2005).
  15. Ventura, R. E., Goldman, J. E. Dorsal radial glia generate olfactory bulb interneurons in the postnatal murine brain. J Neurosci. 27, 4297-4302 (2007).
  16. Kelsch, W., Mosley, C. P., Lin, C. W., Lois, C. Distinct mammalian precursors are committed to generate neurons with defined dendritic projection patterns. PLoS Biol. 5, e300 (2007).
  17. Wang, X. Asymmetric centrosome inheritance maintains neural progenitors. Nature. 461, 947-955 (2009).
En yüze Subventricular Bölge: Wholemount Boyama ve ependim Akış
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).More

Mirzadeh, Z., Doetsch, F., Sawamoto, K., Wichterle, H., Alvarez-Buylla, A. The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow. J. Vis. Exp. (39), e1938, doi:10.3791/1938 (2010).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter