Summary
توضح هذه المقالة الإجراءات لفحص الانبثاث التجريبية التي تستخدم لتحديد إمكانية النقيلي من خطوط الخلايا السرطانية البشرية.
Abstract
الانبثاث هي السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى السرطان. لفهم آلية من ورم خبيث ، أنشئت لفحص الانبثاث تجريبية باستخدام الفئران العوز المناعي. هذه المادة يحدد الإجراءات التي ينطوي عليها هذا الاختبار ، بما في ذلك إعداد العينات ، والحقن في الوريد ، واستنبات الخلايا من الانبثاث الرئة. لفترة وجيزة ، تم إعداد عدد محدد مسبقا من الخلايا السرطانية البشرية
Protocol
1. تحضير العينة
- تنمو الخلايا لمتموجة ~ 70 ٪ في وسائل الإعلام الخاصة بها مع عوامل النمو أو FBS (على سبيل المثال ، مع DMEM FBS 10 ٪ لMC - 1 الخلايا). نضح من وسائل الاعلام لوحة ، ويغسل بلطف عدة مرات مع PBS × 1 (8 ز / لتر من كلوريد الصوديوم ، 0.2 غرام / لتر من بوكل ، 1.15 جم / لتر من نا 2 4 هبو 0.7 H 2 O ، 0.2 غرام / لتر من KH 2 PO 4 ، ودرجة الحموضة 7.3).
- برنامج تلفزيوني ونضح إضافة 2 مل من التربسين 0.05 ٪ في versene (0.014 غرام / لتر من أحمر الفينول و 0.2 غرام / لتر من EDTA - نا في برنامج تلفزيوني × 1 ، ودرجة الحموضة 7.2). صخرة بلطف لوحة لتسهيل مفرزة الخلية من لوحة. مراقبة الخلايا تحت المجهر. وعادة ما يستغرق 2-5 دقائق للفصل الخلايا.
- إضافة وحدة تخزين وافرة من وسائل الإعلام التي تحتوي على FBS (فول الصويا أو مثبط التربسين) لإخماد النشاط التربسين وجمع الخلايا في أنبوب الصقر 50mL. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تحميل 10μL التعليق الخلية في الصعود إلى عدادة الكريات نظيفة. عدد الخلايا في مل يساوي متوسط عدد الخلايا في كل من المربعات five مضروبا 10 4.
- الطرد المركزي الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة (أو 200 ~ XG) في أجهزة الطرد المركزي الفوق لمدة 3 دقائق.
- إزالة بعناية وسائل الاعلام من دون إزعاج بيليه الخلية. Resuspend الخلايا في حجم مناسب من الحل المتوازن الاحتياطي هانكس (HBSS) للوصول إلى التركيز النهائي لل~ 5 × 10 6 خلية / مل.
- تصفية الخلايا خلال 70 ميكرومتر فالكون مصفاة خلية خلية لاستبعاد المجاميع الكبيرة. مكان غيض من ماصة مباشرة على تصفية أكثر من الأنبوب المسمى 5mL الثقافة فالكون. إخراج بسرعة تعليق من خلال تصفية في أنبوب الثقافة.
- عد مرة أخرى باستخدام خلايا عدادة الكريات وتمييع لهم تركيز النهائي من 2.5 × 10 مل / 6. تبقي الخلايا على الجليد.
- تحديد الجدوى من الخلايا. خلط بعض الخلايا مع الأزرق التريبان وقياس نسبة الخلايا (الأزرق) الى طريق مسدود بسبب الخلايا مجموع باستخدام عدادة الكريات. ينبغي أن يكون بقاء الخلايا ≥ 90 ٪ قبل الحقن.
2. حقن في الوريد
- تغيير القفازات. انتزاع بلطف ذيل ماوس العوز المناعي (عارية ، NOD - SCID ، أو مجموعة موردي المواد النووية ، مختبر جاكسون) ، وتسحبه إلى restrainer الماوس ، مع ظهرها ضد الشق وذيله تخرج من فتحة صغيرة في الجزء الخلفي من restrainer .
- الشريحة ببطء على طول الحلبة الشق الداخلي وقفل مرة واحدة في مكان الحلبة يمسك الفم من الفأرة. ينبغي أن لا يكون الماوس قادرة على التحرك بحرية ، ولكن ينبغي أن يكون المعدل الطبيعي للتنفس.
- العثور على أوردة الذيل الرئيسية. أربعة الأوعية الدموية الرئيسية موجودة في ذيل الفأر. الأوعية الدموية على جانبي ظهري وبطني من الذيل والشرايين. الأوردة الموجودة على الجانبين الوحشي الذيل.
- تعادل أكثر من 200 ميكرولتر من خلايا المعدة إلى حقنة 1mL. إرفاق الإبرة 30 G1 / 2 بوصة ، وطرد أي فقاعات الهواء التي قد تكون موجودة. وينبغي أن الحجم النهائي للخلايا في حقنة سيكون 200 ميكرولتر (أي 5 × 10 5 خلايا في المجموع).
- حقن الخلايا في الوريد الذيل.
- أبدأ من النهاية البعيدة من الذيل ، حتى إذا فشل في المحاكمة الأولى ، ويمكن استخدام هذه المنطقة القريبة من أكثر الذيل لمحاولة ثانية.
- مسح الذيل مع الايثانول 70 ٪. سحب الذيل على التوالي. الاستمرار على طرف الذيل مع الإبهام ودعم للحقن نقطة مع السبابة.
- ادخال الإبرة في الوريد وحقن الخلايا. تأكد من أن الإبر والمحاقن موازية لالوريد خلال الحقن ، وإلا فإن الإبرة كزة من خلال جدار الوعاء الدموي وحقن هذه الخلايا في الأنسجة المجاورة الذيل.
- سحب الإبرة بعد الحقن. وينبغي أن الدم الغزير من موقع الحقن إذا ذهب حقن بنجاح. اضغط قطعة نظيفة من منشفة ورقية أو مسحة القطن في موقع الحقن لتسهيل تخثر الدم ، وجس صعودا الذيل لدفع أي عينة المتبقية في الوريد في التداول.
- الافراج عن الماوس من restrainer وإعادته إلى القفص. سجل عملية الحقن (على سبيل المثال ، كم عدد التجارب التي اتخذها لحقن الخلايا وإلى أي مدى تم حقن الخلايا) في دفتر المختبر.
- تحديد الجدوى من الخلايا بعد الحقن ، كما هو موضح في قسم إعداد العينات ، والخطوة 9. هذه الخطوة توفر الاطمئنان إلى أن خلايا البقاء على قيد الحياة خلال عملية الحقن. في نهاية تجربة الحقن ، فإن بقاء الخلايا الانخفاض ، ولكن ينبغي أن يكون فوق 80 ٪.
- (اختياري) تدور باستمرار على بقايا الخلايا وشطف الكريات مع برنامج تلفزيوني واحد. تجميد -80 درجة مئوية في الكريات لتحليل المستقبل (على سبيل المثال ، للتأكد من البقع الغربي التعبير الجيني أو knockdowns).
- عادة بعد شهر أو شهرين ، سيتم تشريح الفئران ، ونحن مصممون على نحو فاضح مواقع الانبثاث. الرئة هو الموقع الرئيسي لورم خبيث ، حيث أنه يحتوي على سرير first الشعرية أن الخلايا اللقاء بعد اندخول الدورة الدموية.
- بعد الشطف مع برنامج تلفزيوني ، كل فص من الرئة (أو الأنسجة الأخرى التي تحتوي على الانبثاث) لوحظ تحت المجهر تشريح (الشكل 1). يتم احتساب عدد الانبثاث يمكن كشفها في كلا الجانبين من الرئة وتضاف أعداد الانبثاث الرئة على جميع أربعة فصوص معا في العدد الإجمالي للالانبثاث الرئة ويتم الكشف عنها بسهولة أكبر الانبثاث الرئة 1 إذا تم إصلاحها في الرئتين بين عشية وضحاها الفورمالين منذ سوف الانبثاث apppear كبقع بيضاء على النقيض من الظلام المتاخمة أنسجة الرئة البني.
3. زراعة خلايا الرئة من الانبثاث
- معزولون الانبثاث الرئة من الفئران المحقونة. وينبغي لكل مثقف بشكل منفصل.
- هو كل مفروم الانبثاث بحلول نهاية قبعة إبرة (معقمة) على مصفاة ميكرومتر الخلية 70.
- شطف مصفاة مع خلية تراخيص العديد من الخلايا التي تم جمعها والمتوسطة والتي تمر من خلال مصفاة في صحن الثقافة.
- احتضان الخلايا على 37 درجة مئوية على الأقل أربعة أيام من دون ازعاج.
- يغسل الدم أو الأنسجة الحطام على الطبق مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة المتوسطة الطازجة. في البداية ، كل من الخلايا السرطانية والخلايا الليفية تنمو على لوحات ، ولكن تدريجيا ، والخلايا الليفية سوف تنقرض وتحل محلها خلايا السرطان. إذا كانت الخلايا السرطانية تحمل أي جينات مقاومة للأدوية ، وحدد الخلايا التي تحتوي على المضادات الحيوية ذات الصلة.
- ويتم تقييم نقاء من الخلايا التي يجنيها immunostaining باستخدام أجسام مضادة ضد البشرية محددة البروتينات. نستخدم الأضداد المضادة للvimentin الإنسان (NCL - VIM - V9 ، Novocastra). الخلايا المشتقة نحن تحتوي عادة على أكثر من 99 ٪ من الخلايا البشرية ، حتى في غياب التحديد المخدرات. ويمكن حقن الخلايا المشتقة حديثا مرة أخرى إلى الفئران لاختبار العوز المناعي قدراتهم المتنقل ، كما هو موضح أعلاه.
4. ممثل النتائج
- في نهاية هذا الاختبار ، وخلية السرطان النقيلي للغاية خط يعطي عادة إلى ظهور العديد من الرئة الانبثاث (الشكل 1) ، 1 في حين الانبثاث الرئة عدد قليل جدا سيأتي من خط خلية السرطان النقيلي سيئة.
- الخلايا المشتقة باستخدام هذا الأسلوب عادة ما تعطي ترتفع إلى أكثر من خط الانبثاث الوالدين ، وعندما يتم اختبارها مرة أخرى باستخدام هذا الاختبار. 1-3
صور الممثل الشكل 1. الرئتين الماوس بعد حقن الوريد ذيل الخلايا السرطانية. تم حقن 5 × 10 5 من سرطان الجلد المنتشر الإنسان خط الخلية ، وخلايا SM ، و 4 في الوريد ذيل الفئران العوز المناعي. بعد ذلك بشهرين ، تم عزل الرئتين وعثر الانبثاث فرقت بين أنسجة الرئة العادية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الانبثاث هي السبب الرئيسي للوفاة لدى مرضى السرطان. أنها تنطوي على أربع خطوات رئيسية : المفرزة من الخلايا السرطانية من مواضع الأساسي ، دخولهم في التداول (intravasation) ، خروجهم من التداول (التسرب) ، والبقاء والنمو في الجهاز البعيد. يعتبر ورم خبيث في الإنسان عملية بطيئة وتجلت في كثير من الأحيان بعد سنوات من الكمون. لدراسة التقدم في الوقت المناسب ، وقد تم تأسيسها في أعلاه مقايسة تجريبية سريعة نسبيا في الفئران العوز المناعي 4 منذ تأسيسها ، وقد تم استخدامه بشكل فعال لعزل الخلايا النقيلي مع قدرات مختلفة ، وتحديد الجينات التي هي أعلى أو إلى أسفل التنظيم خلال الانبثاث 1،2،5 ، و 3 أدوار اختبار السببية لهذه الجينات خلال الانبثاث.
الخطوة الأكثر تحديا في هذا الاختبار هي حقن الخلايا في الوريد الذيل. فإنه يأخذ الممارسات لإتقان المهارات عن طريق الحقن. حتى بالنسبة للباحث خبرة وتجارب عدة قبل التوصل إلى حقن ناجحة شائعة جدا. الأوردة في ذيول الماوس هي إبر رقيقة للغاية ، وإدراج الحق في منتصف منها ليس بالأمر السهل. يمكن الاحماء الذيل لفترة وجيزة باستخدام المصباح وتدليك بلطف الذيل قبل الحقن لحث تمدد الأوعية الدموية وتسهيل الحقن. وهناك خطأ شائع لمعظم الباحثين هو أن نفترض أن أوردة عميقة في الذيل ، وبالتالي ضخ خلايا عميقة جدا في الجلد. الأوردة هي في الواقع قريب جدا من سطح الجلد ، ولذا ينبغي للمرء أن يحاول لحقن وبسطحية ممكن.
إذا تم إدراج بنجاح إبرة داخل الوريد ، ينبغي أن حقن بسلاسة مع أي مقاومة. إذا لم يتم إدخال الإبرة في الوريد ولكن في الأنسجة المجاورة ، وسوف حقن عينات بناء ضغط السائل بسرعة ومن ثم منع تسليم بقية العينات. سيكون لكل من هذه التجارب الفاشلة وبالتالي تفقد بعض العينات. للحد من هذه الخسارة ، وهو باحث من ذوي الخبرة يحاول التنبؤ بما اذا كانت الإبرة في الوريد أو لا عن طريق حقن كمية صغيرة من العينة وتقدير مقاومة من ضغط السائل. اذا شعر المقاومة ، يجب أن لا تكون الإبرة في الوريد وانه سوف ثم سحب الإبرة خارجا وحاول مرة أخرى. إذا رأى أي مقاومة ، يجب أن تكون الإبرة في الوريد ، وسيتم ضخ كل عينة في وقت واحد. في الحالة الأخيرة ، يمكن للمرء أن يرى في كثير من الأحيان عينة "براعم" حتى الوريد ، وتشريد الدم لأنها تشق طريقها نحو الجسم.
عندما لإنهاء ينبغي تحديد مقايسة تجريبيا لكل خط الخلية ، لأنه يختلف إلى حد كبير على إمكانات المنتشر من الخلايا. وسيتم تشريح الفئران في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن ، ويتم تحديد مدى انتشار ورم خبيث في الرئة. وطول الفترة الزمنية التي يتم اختيارها عادة النتائج في عدد معدود من الانبثاث الرئة كشف المجهري ، لأنه يعطي نتيجة الكمي ، وكذلك يترك مجالا لأية زيادة أو نقصان الانبثاث الناجمة عن اضطراب في الجينات المرشحة. للباحثين الذين يؤدون هذا الاختبار لأول مرة ، وذلك باستخدام خط خلية المنتشر جدا (مثل سرطان الجلد خط الخلية البشرية ، A375 ، أو مشتقاته المنتشر جدا) كعنصر تحكم إيجابية ينصح بشدة. علاوة على ذلك ، الأعمار والأجناس من الفئران يؤثر على النتائج بشكل ملحوظ ، لذلك ينصح للحفاظ على الأعمار والجنس متسقة عند مقارنة قدرات النقيلي من خطوط مختلفة من الخلايا. بسبب التغيرات التي أدخلتها على العوامل المذكورة أعلاه ، ينبغي أن لا يقل عن خمس حقن الفئران لكل خط الخلية لتصل إلى أي نتيجة ذات دلالة إحصائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم اختبار هذا البروتوكول وتحسينه في البداية في مختبر الدكتور ريتشارد هينز (MIT). يتم توفير التمويل من جانب NYSTEM جائزة IDEA (لLX) وروث L. كيرشتاين خدمة القومي للبحوث جائزة (لLX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
