Summary
Dit artikel beschrijft de procedures van een experimentele metastase test die wordt gebruikt om de metastatisch potentieel van kanker bij de mens cellijnen te bepalen.
Abstract
Metastase is de belangrijkste oorzaak van overlijden bij patiënten met kanker. Om te begrijpen van het mechanisme van metastase, was een experimenteel metastase assay bepaald aan de hand immunodeficiënte muizen. Dit artikel schetst de procedures die in deze test, inclusief monstervoorbereiding, intraveneuze injectie, en het kweken cellen van longmetastasen. In het kort werden een vooraf bepaald aantal van menselijke kankercellen voorbereid
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Grow cellen ~ 70% confluent in hun specifieke media met groeifactoren of FBS (bijvoorbeeld DMEM met 10% FBS voor de MC-1-cellen). Aspireren media van plaat-en voorzichtig een paar keer wassen met 1 x PBS (8 g / L NaCl, 0,2 g / L KCl, 1,15 g / L van Na 2 HPO 4 0.7 H 2 O, 0,2 g / L van KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Aspireren PBS en voeg 2 ml van 0,05% trypsine in Versene (0,014 g / L van fenol rood en 0,2 g / L EDTA-Na in 1 x PBS, pH 7,2). Schud plaat cel onthechting te vergemakkelijken van de plaat. Let op de cellen onder een microscoop. Het duurt meestal 2-5 minuten voor de cellen los te maken.
- Voeg een ruime hoeveelheid media met FBS (of soja-trypsine-remmer) aan de trypsine-activiteit doven en cellen te verzamelen in een 50 ml falcon buis. Tellen cellen met behulp van een hemacytometer. Load 10μL van de celsuspensie op een schone hemacytometer. Het aantal cellen per ml is gelijk aan het gemiddelde # van cellen in elk van de vijf pleinen, vermenigvuldigd met 10 4.
- Centrifugeer de cellen bij 1000 RPM (of ~ 200 xg) in een benchtop centrifuge gedurende 3 minuten.
- Verwijder voorzichtig de media zonder de cel pellet. Resuspendeer cellen in een geschikt volume van Hanks Balanced Buffer Solution (HBSS), tot een uiteindelijke concentratie van ~ 5 x 10 6 cellen / ml te bereiken.
- Filter cellen via een Falcon 70 um cel zeef om grote cel aggregaten uit te sluiten. Plaats de punt van de pipet direct op het filter over een gelabelde 5 ml Falcon buis cultuur. Snel uitwerpen van de schorsing door de filter in de cultuur buis.
- Opnieuw tellen cellen met behulp van een hemacytometer en verdun ze tot een uiteindelijke concentratie van 2,5 x 10 6 / ml. Houden cellen op ijs.
- Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen. Meng een aantal cellen met trypan blauw en meet het percentage van dode (blauwe) cellen over de totale cellen met behulp van een hemacytometer. De levensvatbaarheid van de cellen moet ≥ 90% voorafgaand aan de injectie.
2. Intraveneuze injectie
- Veranderen handschoenen. Voorzichtig pak je de staart van een immunodeficiëntie muis (naakt, NOD-SCID, of NSG, Jackson's Laboratory) en trek hem in de muis restrainer, met zijn rug tegen de gleuf en de staart uit de kleine opening in de achterkant van de restrainer .
- Langzaam schuift de ring naar binnen langs de gleuf en vergrendel deze op zijn plaats zodra de ring vangt de monding van de muis. De muis mag niet vrij kunnen bewegen, maar moet normaal van de ademhaling te hebben.
- Zoek de grote staart aderen. Vier grote bloedvaten aanwezig zijn in een muis staart. Bloedvaten op de dorsale en ventrale zijden van de staart zijn slagaders. Aders zijn op de zijkanten van de staart.
- Teken meer dan 200 pi van de bereide cellen in een 1 ml spuit. Bevestig de 30 G1 / 2 inch naald en duw eventuele luchtbellen weg die kunnen bestaan. Het uiteindelijke volume van cellen in de spuit moet 200 pi (dat wil zeggen, 5 x 10 5 cellen in totaal) zijn.
- Injecteer cellen in de staart ader.
- Start vanaf het distale uiteinde van de staart, dus als de eerste proef mislukt, een meer proximaal gebied van de staart kon worden gebruikt voor een tweede poging.
- Veeg de staart met 70% ethanol. Trek de staart. Houd het uiteinde van de staart met duim en ondersteuning van het punt voor injectie met de wijsvinger.
- Steek de naald om de ader te injecteren en de cellen. Zorg ervoor dat de naald en spuit zijn parallel aan de ader tijdens de injectie, anders kan de naald steken door middel van de vaatwand en injecteer de cellen in het aangrenzende staart weefsels.
- Trek de naald na de injectie. Bloed moet overvloedig uit de injectieplaats, indien de injectie ging met succes. Druk op een schoon stuk papier handdoek of een wattenstaafje op de injectieplaats te faciliteren stolling, en palperen de staart omhoog om eventueel resterende monster duw in de ader in omloop gebracht.
- Laat de muis van de weerhouder en terug in de kooi. Noteer de injectie proces (bijvoorbeeld, hoeveel proeven nodig was om de cellen te injecteren en hoeveel cellen werden geïnjecteerd) in een lab notebook.
- Bepaal de levensvatbaarheid van de cellen na injectie, zoals beschreven in de sectie van monstervoorbereiding, Stap 9. Deze stap biedt geruststelling dat de cellen in leven te blijven gedurende de injectie proces. Aan het einde van een injectie experiment, zal de levensvatbaarheid van de cellen verval, maar moet hoger zijn dan 80%.
- (Optioneel) Spin beneden de overgebleven cellen en een keer spoel de korrels met PBS. Bevriezing van de pellets bij -80 oC voor toekomstige analyses (bijvoorbeeld, western blots van genexpressie of knockdowns te bevestigen).
- Meestal na een of twee maanden zal de muizen worden ontleed en de locaties van de uitzaaiingen zijn schromelijk bepaald. Lung is de primaire site voor metastase, want het bevat de eerste capillaire bed, dat de cellen tegenkomen nadat zeVoer de circulatie.
- Na het spoelen met PBS, elk kwab van de long (of andere weefsels die metastasen) is waargenomen onder een dissectiemicroscoop (figuur 1). Het aantal detecteerbare uitzaaiingen aan beide zijden van de longen is geteld en de aantallen van longmetastasen op alle vier kwabben worden bij elkaar opgeteld als het totale aantal longmetastasen. 1 longmetastasen gemakkelijker gedetecteerd als de longen worden gefixeerd in formaline 's nachts , omdat de uitzaaiingen zal apppear als wittige plekken in tegenstelling tot de naast elkaar gelegen donkere bruine longweefsel.
3. Kweken Cellen van longmetastasen
- Longmetastasen zijn geïsoleerd van geïnjecteerde muizen. Elk moet afzonderlijk worden gekweekt.
- Elke metastase wordt gehakt door het einde van een naald (steriele) op een 70 um cel zeef.
- Spoel de cel zeef met een aantal ml van middelgrote en verzamelde cellen die door het filter passeren in een cultuur schotel.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende ten minste vier dagen zonder verstoring.
- Afwassen bloed of weefsel vuil op de schotel met PBS.
- Voeg vers medium. In het begin, zowel kankercellen en fibroblast cellen groeien op de platen, maar geleidelijk, de fibroblast cellen zullen sterven uit en worden vervangen door kankercellen. Als de kankercellen te voeren elke drug resistente genen, selecteert u de cellen met bijbehorende antibiotica.
- De zuiverheid van de afgeleide cellen wordt beoordeeld door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen humaan-specifieke eiwitten. We maken gebruik van een anti-humaan antilichaam vimentine (NCL-VIM-V9, Novocastra). De cellen hebben we afgeleid bevatten meestal meer dan 99% van de menselijke cellen, zelfs in de afwezigheid van de drug selectie. De nieuw verkregen cellen kunnen weer worden geïnjecteerd in immunodeficiënte muizen om hun gemetastaseerde vaardigheden te testen, zoals hierboven beschreven.
4. Representatieve resultaten
- Aan het eind van deze test, een zeer uitgezaaide kanker cellijn geeft meestal aanleiding tot veel longmetastasen (figuur 1), 1 terwijl heel weinig longmetastasen zal komen van een slecht uitgezaaide darmkanker cellijn.
- Afgeleid van de cellen met behulp van deze methode meestal aanleiding geven tot meer uitzaaiingen dan de ouderlijke lijn, wanneer ze opnieuw getest met deze test. 1-3
Figuur 1. Representatieve beelden van de muis longen na staartader injecties van kankercellen. 5 x 10 5 van de uitgezaaide melanoom menselijke cellijn, SM-cellen, vier werden geïnjecteerd in de staartader van immunodeficiënte muizen. Twee maanden later werden de longen geïsoleerd en uitzaaiingen werden gevonden verspreid onder de normale longweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metastase is de belangrijkste oorzaak van overlijden bij patiënten met kanker. Het gaat om vier belangrijke stappen: losmaken van kankercellen uit hun primaire loci, in het verkeer brengen (intravasation), hun exit uit de circulatie (extravasatie), en overleving en de groei in een verre orgaan. Metastasen in de mens wordt beschouwd als een langzaam proces en vaak gemanifesteerd na jaren van latentie. Het bestuderen van de progressie in een tijdig, was de bovenstaande relatief snel experimentele test opgericht in immunodeficiënte muizen. 4 Sinds haar oprichting, is het effectief gebruikt om de cellen met verschillende uitgezaaide vaardigheden te isoleren, te identificeren genen die zijn up-of down-gereguleerd tijdens de metastase 1,2,5, en test de causale rol van deze genen tijdens de metastase. 3
De meest uitdagende stap in deze test is om cellen te injecteren in de staart ader. Het duurt praktijken onder de knie het injecteren van vaardigheden. Zelfs voor een ervaren onderzoeker, een aantal processen voor het realiseren van een succesvolle injectie komen zeer vaak voor. Aderen in de muis staarten zijn extreem dun en steek naalden in het midden van hen is niet eenvoudig. Het opwarmen van de staart kort met behulp van een lamp en zachtjes masseren van de staart voor injecties zou kunnen veroorzaken verwijding van de bloedvaten en vergemakkelijkt injecties. Een veelgemaakte fout voor de meeste onderzoekers is om aan te nemen dat de aderen zijn diep in de staart en daarom injecteren cellen te diep in de huid. Aders zijn eigenlijk heel dicht bij het oppervlak van de huid, daarom moet men proberen zo ondiep injecteren mogelijk te maken.
Als de naald is met succes ingebracht in de ader, dient de injectie soepel verlopen zonder weerstand. Als de naald zich niet in de ader, maar in de aangrenzende weefsels, geïnjecteerd monsters zullen opbouwen vloeistofdruk snel en dan voorkomen dat de levering van de rest van de monsters. Elk van deze mislukte proeven zal dus verliest enkele voorbeelden. Om dit verlies te minimaliseren, een ervaren onderzoeker probeert te voorspellen of de naald in de ader of niet door het injecteren van een minimale hoeveelheid van het monster en de beoordeling van de weerstand van de vloeistof druk. Als hij voelt de weerstand, moet de naald niet in de ader en hij zal trek de naald eruit en probeer het opnieuw. Als er geen weerstand wordt gevoeld, moet de naald in de ader en alle van het monster wordt geïnjecteerd in een keer. In het laatste geval kan men vaak het monster "schiet" de ader, het verplaatsen van het bloed want het maakt zijn weg in de richting van het lichaam.
Wanneer te beëindigen van de test moet empirisch worden bepaald voor elke cellijn, omdat het varieert aanzienlijk, afhankelijk van de metastatische potentieel van de cellen. Muizen zal worden ontleed op verschillende tijdstippen na injectie en de mate van long metastase is bepaald. Een lengte van de tijd die resulteert in een telbare aantal microscopisch detecteerbaar longmetastasen meestal wordt gekozen, want het geeft een kwantitatief resultaat en laat ook ruimte voor een stijging of daling van metastasen veroorzaakt door de verstoring van kandidaat-genen. Voor onderzoekers die het uitvoeren van deze test voor de eerste keer, met behulp van een zeer gemetastaseerde cellijn (zoals het menselijk melanoom cellijn, A375, of zijn zeer metastatische derivaten) als een positieve controle wordt ten zeerste aanbevolen. Bovendien, leeftijden en geslachten van muizen de resultaten sterk beïnvloeden, dus het is aangeraden om de leeftijd en het geslacht consistent te houden wanneer de metastatische capaciteiten van verschillende cellijnen worden vergeleken. Vanwege de veranderingen die door de bovengenoemde factoren, moeten ten minste vijf muizen geïnjecteerd worden voor elke cel lijn naar alle statistisch significante conclusies te komen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit protocol werd getest en geoptimaliseerd in eerste instantie in het laboratorium van Dr Richard Hynes (MIT). De financiering wordt verstrekt door de NYSTEM IDEA Award (voor LX) en Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (voor LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
