Summary
Cet article décrit les procédures d'un essai de métastases expérimentales qui est utilisé pour déterminer le potentiel métastatique de lignées cellulaires humaines de cancer.
Abstract
Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Pour comprendre le mécanisme de métastases, un essai de métastases expérimentales a été établi en utilisant des souris immunodéficientes. Cet article définit les procédures impliquées dans cet essai, y compris la préparation des échantillons, l'injection intraveineuse, et la culture de cellules de métastases pulmonaires. Brièvement, un nombre prédéterminé de cellules cancéreuses humaines ont été préparés
Protocol
1. Préparation des échantillons
- Cultiver des cellules confluentes à ~ 70% dans leurs médias spécifiques avec des facteurs de croissance ou de FBS (par exemple, DMEM avec du FBS à 10% pour le MC-1 cellules). Aspirer des médias de la plaque et laver délicatement à plusieurs reprises avec 1 x PBS (8 g / L de NaCl, 0,2 g / L de KCl, 1,15 g / L de Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 0,2 g / L de KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Aspirer PBS et ajouter 2 mL de trypsine à 0,05% en versène (0,014 g / L de rouge de phénol et 0,2 g / L d'EDTA-Na dans 1 x PBS, pH 7,2). Secouez doucement la plaque pour faciliter le détachement des cellules de la plaque. Observez les cellules sous un microscope. Il prend généralement 2-5 minutes pour les cellules à se détacher.
- Ajouter un volume suffisant de médias contenant FBS (ou inhibiteur de la trypsine de soja) pour étancher l'activité de la trypsine et de recueillir les cellules dans un tube de 50 ml faucon. Compter les cellules en utilisant un hématimètre. Charge 10 pi de suspension cellulaire sur un hématimètre propre. Le nombre de cellules par mL est égal à la moyenne # des cellules dans chacune des cinq carrés multipliée par 10 4.
- Centrifuger les cellules à 1000 RPM (ou ~ 200 xg) dans une centrifugeuse de paillasse pendant 3 minutes.
- Retirez délicatement les médias, sans perturber le culot cellulaire. Resuspendre les cellules dans un volume approprié de solution tampon Hanks Balanced (HBSS) pour atteindre une concentration finale de ~ 5 x 10 6 cellules / ml.
- Filtrer à travers les cellules d'un Falcon 70 tamis cellulaire um d'exclure des agrégats à grandes cellules. Placez l'extrémité de la pipette directement sur le filtre sur un tube étiqueté culture 5mL Falcon. Vite éjecter la suspension à travers le filtre dans le tube de culture.
- Compter les cellules de nouveau en utilisant un hématimètre et les diluer à une concentration finale de 2,5 x 10 6 / mL. Gardez les cellules sur la glace.
- Déterminer la viabilité des cellules. Mélanger quelques cellules au bleu trypan et de mesurer le pourcentage de morts (en bleu) des cellules sur les cellules total en utilisant un hématimètre. La viabilité des cellules doit être ≥ 90% avant l'injection.
2. Injection par voie intraveineuse
- Changer de gants. Doucement attraper la queue d'une souris immunodéficientes (nude, NOD-SCID, ou GFN, Laboratoire Jackson) et tirez dans le dispositif de retenue de la souris, avec son dos contre la fente et sa queue qui sortait de la petite ouverture dans le dos de la de contention .
- Faites glisser lentement vers l'intérieur de l'anneau le long de la fente et le verrouiller en place une fois l'anneau des prises de l'embouchure de la souris. La souris ne doit pas être en mesure de se déplacer librement, mais doivent avoir le taux normal de la respiration.
- Trouvez les veines de la queue majeur. Quatre vaisseaux sanguins principaux sont présents dans une queue de souris. Les vaisseaux sanguins sur les côtés dorsale et ventrale de la queue sont les artères. Les veines sont sur les côtés latéraux de la queue.
- Attirer plus de 200 ul de cellules préparées dans une seringue 1ml. Fixez l'aiguille 30 G 1 / 2 pouce et pousser les bulles d'air qui peuvent exister. Le volume final de cellules dans la seringue doit être 200 uL (soit 5 x 10 5 cellules au total).
- Injecter des cellules dans la veine de la queue.
- Démarrer à partir de l'extrémité distale de la queue, donc si le premier essai échoue, une région plus proximale de la queue pourrait être utilisé pour un deuxième essai.
- Essuyez la queue avec 70% d'éthanol. Tirez sur la queue droite. Maintenez la pointe de la queue avec le pouce et l'appui du point d'injection avec l'index.
- Insérez l'aiguille de la veine et injecter les cellules. Assurez-vous que l'aiguille et la seringue sont parallèles à la veine lors de l'injection, sinon l'aiguille se pointer à travers la paroi du vaisseau et d'injecter les cellules dans les tissus adjacents queue.
- Retirez l'aiguille après l'injection. Le sang doit abondante à partir du site d'injection si l'injection est allé avec succès. Appuyez sur un morceau propre de serviette en papier ou un coton tige sur le site d'injection pour faciliter la coagulation, et palper la queue vers le haut pour pousser tout échantillon résiduel dans la veine en circulation.
- Relâchez la souris à partir du dispositif de retenue et de le retourner à la cage. Enregistrez le processus d'injection (par exemple, combien d'essais il a fallu à injecter les cellules et combien cellules ont été injectées) dans un cahier de laboratoire.
- Déterminer la viabilité des cellules après l'injection, comme décrit dans la Section de préparation des échantillons, étape 9. Cette étape permet de rassurer que les cellules rester en vie tout au long du processus d'injection. A la fin d'une expérience d'injection, la viabilité des cellules vont diminuer, mais devrait être supérieure à 80%.
- (Optionnel) Isoler les cellules et rincer les restes les boulettes avec du PBS fois. Congelez les boulettes à -80 oC pour les analyses futures (par exemple, Western blot pour confirmer l'expression des gènes ou des passes rabattues).
- Généralement, après un ou deux mois, les souris seront disséqués et les emplacements des métastases sont grossièrement déterminée. Du poumon est le site principal de métastases, car il contient le premier lit capillaire que les cellules après leur rencontrepénétrer dans la circulation.
- Après rinçage avec du PBS, chaque lobe du poumon (ou d'autres tissus contenant des métastases) est observé sous un microscope à dissection (figure 1). Le nombre de métastases décelables sur les deux côtés du poumon est compté et le nombre de métastases pulmonaires sur l'ensemble des quatre lobes sont ajoutées comme le nombre total de métastases pulmonaires. 1 métastases pulmonaires sont plus facilement détectées si les poumons sont fixés dans le formol durant la nuit , puisque les métastases se apppear que taches blanchâtres, contrairement à l'sombres adjacents tissus pulmonaires brun.
3. La culture de cellules de métastases pulmonaires
- Métastases pulmonaires sont isolés de souris injectées. Chacun doit être cultivées séparément.
- Chaque métastase est hachée par la fin d'un capuchon de l'aiguille (stérile) sur un tamis 70 pm cellule.
- Rincer la crépine de cellule avec plusieurs mls de milieu et les cellules recueillies qui passent par le filtre dans une boîte de culture.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant au moins quatre jours sans perturbation.
- Laver le sang ou les débris de tissu sur le plat avec du PBS.
- Ajouter un milieu frais. Au début, les cellules cancéreuses et les cellules fibroblastes se développent sur les plaques, mais progressivement, les cellules de fibroblastes va mourir et être remplacées par des cellules cancéreuses. Si les cellules cancéreuses portent pas de gènes résistant aux médicaments, sélectionnez les cellules avec des antibiotiques correspondants.
- La pureté des cellules dérivées est évaluée par immunomarquage utilisant des anticorps contre des protéines spécifiques de l'homme. Nous utilisons un anticorps anti-vimentine humaine (NCL-VIM-V9, Novocastra). Les cellules nous avons dérivé contiennent typiquement plus de 99% de cellules humaines, même en l'absence de sélection des médicaments. Les cellules nouvellement obtenues pourraient être injectés dans des souris immunodéficientes nouveau de tester leurs capacités métastatiques, comme décrit ci-dessus.
4. Les résultats représentatifs
- A la fin de cet essai, une ligne du cancer métastatique des cellules hautement donne habituellement lieu à de nombreuses métastases pulmonaires (figure 1), 1 alors que les métastases pulmonaires très peu proviennent d'une lignée de cellules cancéreuses métastatiques mal.
- Les cellules obtenues à l'aide de cette méthode donne généralement lieu à plus de métastases que la lignée parentale, quand ils sont testés à nouveau en utilisant ce dosage. 1-3
Images représentant la figure 1. Des poumons de souris après des injections dans la veine caudale des cellules cancéreuses. 5 x 10 5 de la ligne de mélanome métastatique de cellules humaines, cellules SM, 4 ont été injectés dans la veine de la queue des souris immunodéficientes. Deux mois plus tard, les poumons ont été isolées et les métastases ont été trouvés dispersés parmi le tissu pulmonaire normal.
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Discussion
Les métastases sont la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer. Elle comporte quatre grandes étapes: le détachement des cellules cancéreuses de leurs loci primaire, leur mise en circulation (intravasation), leur sortie de la circulation (extravasation), et la survie et la croissance dans un organe à distance. Métastase dans l'homme est considéré comme un processus lent et qui se manifeste souvent après des années de latence. Pour étudier sa progression en temps opportun, le test ci-dessus relativement rapide expérimental a été mis en place dans des souris immunodéficientes. 4 Depuis sa création, il a été utilisé efficacement pour isoler des cellules avec différentes capacités métastatiques, d'identifier les gènes qui sont en amont ou en aval régulée au cours métastases 1,2,5, et de tester le rôle causal de ces gènes au cours de la métastase. 3
L'étape la plus difficile dans ce test consiste à injecter des cellules dans la veine de la queue. Il prend pratiques pour maîtriser les compétences d'injection. Même pour un chercheur expérimenté, plusieurs essais avant de parvenir à une injection de succès sont très fréquents. Les veines de la queue de la souris sont extrêmement minces aiguilles et d'insérer au milieu d'eux n'est pas facile. Réchauffement de la queue brièvement à l'aide d'une lampe et masser doucement la queue avant les injections pourraient induire une dilatation des vaisseaux sanguins et faciliter les injections. Une erreur commune à la plupart des chercheurs est de supposer que les veines sont profondes dans la queue et donc injecter des cellules trop profondément dans la peau. Les veines sont en fait très proche de la surface de la peau, donc on doit essayer d'injecter que superficiellement que possible.
Si l'aiguille est insérée avec succès à l'intérieur de la veine, l'injection doit aller en douceur et sans résistance. Si l'aiguille n'est pas insérée dans la veine mais dans les tissus adjacents, des échantillons seront injectés accumuler de la pression du liquide rapidement et ensuite d'empêcher la livraison du reste des échantillons. Chacun de ces essais n'ont donc perdre une partie des échantillons. Afin de minimiser cette perte, un chercheur expérimenté essaie de prédire si l'aiguille est dans la veine ou non par l'injection d'un montant minimal de l'échantillon et l'évaluation de la résistance de la pression du fluide. Si il se sent la résistance, l'aiguille ne doit pas être dans la veine et il sera alors retirez l'aiguille et essayez de nouveau. Si aucune résistance se fait sentir, l'aiguille doit être dans la veine et l'ensemble de l'échantillon sera injecté à la fois. Dans ce dernier cas, on peut souvent voir l'exemple de "pousses" jusqu'à la veine, en déplaçant le sang comme il fait son chemin vers le corps.
Lorsque de résilier le dosage doit être déterminée empiriquement pour chaque lignée cellulaire, car il varie considérablement selon les potentialités des cellules métastatiques. Souris seront disséqués à différents moments après l'injection et l'étendue des métastases pulmonaires est déterminé. Un laps de temps qui résulte en un nombre fini de métastases pulmonaires au microscope détectable est généralement choisi, car il donne un résultat quantitatif et aussi laisse place à toute augmentation ou diminution des métastases causée par la perturbation des gènes candidats. Pour les chercheurs qui effectuent ce test pour la première fois, en utilisant une lignée cellulaire hautement métastatiques (tels que la lignée cellulaire de mélanome humain, A375, ou de ses dérivés hautement métastatiques) comme contrôle positif est fortement recommandée. Par ailleurs, l'âge et le sexe des souris affecter les résultats de manière significative, il est donc conseillé de garder les âges et le sexe cohérent lorsque les capacités métastatique de lignées cellulaires différentes sont comparés. En raison des variations introduites par les facteurs mentionnés ci-dessus, au moins cinq souris doit être injecté pour chaque lignée cellulaire pour atteindre une conclusion statistiquement significative.
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Acknowledgments
Ce protocole a été testé et optimisé initialement dans le laboratoire du Dr Richard Hynes (MIT). Le financement est assuré par le prix IDEA NYSTEM (à LX) et Ruth L. Kirschstein Prix national Research Service (à LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
