Summary
In questo articolo vengono descritte le procedure di un test metastasi sperimentale che viene utilizzato per determinare il potenziale metastatico di linee cellulari tumorali umane.
Abstract
Metastasi è la principale causa di morte nei pazienti oncologici. Per capire il meccanismo di metastasi, un test sperimentale metastasi è stata stabilita utilizzando topi immunodeficienti. Questo articolo delinea le procedure coinvolte in questo test, compresa la preparazione del campione, l'iniezione endovenosa, coltura e le cellule di metastasi polmonari. In breve, un pre-determinato numero di cellule tumorali umane sono state preparate
Protocol
1. Preparazione del campione
- Crescere le cellule a confluenti ~ 70% nelle loro supporto specifico con fattori di crescita o FBS (ad esempio, con DMEM 10% FBS per MC-1 le cellule). Aspirare multimediali da piastra e lavare delicatamente più volte con 1 x PBS (8 g / L di NaCl, 0,2 g / L di KCl, 1,15 g / L di Na 2 HPO 4 0,7 H 2 O, 0,2 g / L di KH 2 PO 4, pH 7,3).
- Aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di tripsina 0,05% a versene (0,014 g / L di rosso fenolo e 0,2 g / L di EDTA-Na in 1 x PBS, pH 7,2). Scuotere delicatamente piastra per facilitare il distacco delle cellule dalla piastra. Osservare le cellule al microscopio. Di solito ci vogliono 2-5 minuti per le cellule di staccare.
- Aggiungere un ampio volume di supporti contenenti FBS (o inibitori della tripsina di soia) per estinguere l'attività tripsina e raccogliere le cellule in una provetta da 50mL falco. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Carico 10μL di sospensione cellulare su un emocitometro pulito. Il numero di cellule per ml è pari alla media # delle cellule in ciascuna delle cinque piazze moltiplicato per 10 4.
- Centrifugare le cellule a 1000 RPM (o ~ 200 xg) in una centrifuga da banco per 3 minuti.
- Rimuovere con attenzione i media senza disturbare il pellet. Risospendere le cellule in un volume adeguato di soluzione tampone Hanks bilanciata (HBSS) per raggiungere una concentrazione finale di circa 5 x 10 6 cellule / ml.
- Celle filtranti attraverso un filtro 70 micron cellula Falcon per escludere aggregati a grandi cellule. Posizionare la punta della pipetta direttamente sul filtro su un etichetta 5mL tubo cultura Falcon. Espellere rapidamente la sospensione attraverso il filtro nel tubo di cultura.
- Contare le celle di nuovo con un emocitometro e diluire ad una concentrazione finale di 2,5 x 10 6 / ml. Mantenere le cellule in ghiaccio.
- Determinare la vitalità delle cellule. Mescolare alcune cellule con trypan blu e misurare la percentuale di morti (blu), le cellule sulle celle totale utilizzando un emocitometro. La vitalità delle cellule dovrebbe essere ≥ 90% prima dell'iniezione.
2. Iniezione per via endovenosa
- Cambiare i guanti. Delicatamente afferrare la coda di un topo immunodeficienti (nudo, NOD-SCID, o NSG, Laboratorio di Jackson) e tirarlo nel dispositivo di immobilizzazione mouse, con le spalle contro la fessura e la sua coda spuntava la piccola apertura nella parte posteriore del dispositivo di immobilizzazione .
- Lentamente scivolare l'anello verso l'interno lungo la fessura e bloccarla in posizione una volta che l'anello di cattura della foce del mouse. Il mouse non dovrebbe essere in grado di muoversi liberamente, ma deve avere ritmo normale di respirazione.
- Trova le vene coda importante. Quattro vasi sanguigni più importanti sono presenti in una coda di topo. I vasi sanguigni sui lati dorsale e ventrale della coda sono arterie. Vene sono sui lati laterali della coda.
- Disegna più di 200 ml di cellule preparato in una siringa da 1 ml. Applicare l'ago 30 G1 / 2 pollice e spingere fuori le bolle d'aria che possono esistere. Il volume finale di cellule della siringa deve essere 200 ul (cioè, 5 x 10 5 cellule in totale).
- Iniettare cellule nella vena della coda.
- Inizio dalla fine distale della coda, quindi se la prima prova fallisce, una regione più prossimale della coda potrebbe essere usata per un secondo tentativo.
- Pulire la coda con il 70% di etanolo. Tirare la coda dritta. Tenere la punta della coda con il pollice e sostenere il punto di iniezione con il dito indice.
- Inserire l'ago nella vena e iniettare le cellule. Assicurarsi che l'ago e la siringa sono paralleli alla vena durante l'iniezione, altrimenti l'ago si colpire attraverso la parete del vaso e iniettare le cellule nei tessuti adiacenti coda.
- Ritirare l'ago dopo l'iniezione. Il sangue dovrebbe profuso dal sito di iniezione se l'iniezione è andato con successo. Premere un pezzo pulito di carta assorbente o tampone di cotone sul sito di iniezione per facilitare la coagulazione, e palpare la coda verso l'alto per spingere qualsiasi campione residuo nella vena in circolazione.
- Rilasciare il mouse dal dispositivo di immobilizzazione e restituirlo alla gabbia. Registrare il processo di iniezione (per esempio, quante prove ci sono voluti per iniettare le cellule e quanto le cellule sono state iniettate) in un quaderno di laboratorio.
- Determinare la vitalità delle cellule dopo l'iniezione, come descritto nella Sezione di preparazione del campione, punto 9. Questa operazione fornisce rassicurazione che le cellule rimanere in vita durante tutto il processo di iniezione. Alla fine di un esperimento di iniezione, la vitalità delle cellule diminuirà, ma deve essere superiore a 80%.
- (Opzionale) Spin giù le cellule rimanenti e lavare il pellet una volta con PBS. Congelare il pellet a -80 ° C per le analisi future (ad esempio, Western blot per confermare l'espressione genica o atterramenti).
- Di solito dopo uno o due mesi, i topi saranno sezionati e le posizioni delle metastasi sono grossolanamente determinati. Polmonare è il sito primario per le metastasi, in quanto contiene il primo letto capillare che le cellule incontrano dopoentrano nella circolazione.
- Dopo il risciacquo con PBS, ogni lobo del polmone (o di altri tessuti contenenti metastasi) viene osservato con un microscopio da dissezione (Figura 1). Il numero di metastasi rilevabili su entrambi i lati del polmone e viene contato il numero di metastasi polmonari su tutti i quattro lobi si sommano come il numero totale delle metastasi polmonari 1. Metastasi al polmone sono più facilmente rilevabili se i polmoni sono fissati in formalina durante la notte , in quanto la metastasi si apppear come macchie biancastre in contrasto con la adiacente marrone scuro tessuti polmonari.
3. Cellule coltura da metastasi polmonari
- Metastasi polmonari sono isolati da topi iniettati. Ognuno dovrebbe essere coltivato separatamente.
- Ogni metastasi viene macinata per la fine di un cappuccio (sterile) su un filtro 70 micron cellulare.
- Sciacquare il filtro cella con alcuni ml di medio e cellule raccolte che passano attraverso il filtro in un piatto cultura.
- Incubare le cellule a 37 ° C per almeno quattro giorni senza disturbo.
- Lavare via il sangue o frammenti di tessuto sul piatto con PBS.
- Aggiungi un mezzo fresco. All'inizio, sia le cellule tumorali e cellule di fibroblasti crescono sulle piastre, ma a poco a poco, le cellule di fibroblasti morirà e sarà sostituito da cellule tumorali. Se le cellule tumorali trasportare qualsiasi geni resistenti ai farmaci, selezionare le celle con antibiotici corrispondente.
- La purezza delle cellule derivate viene valutata mediante immunocolorazione utilizzando anticorpi umani contro proteine specifiche. Usiamo un anticorpo anti-umano vimentina (NCL-VIM-V9, Novocastra). Le cellule che contengono derivati tipicamente oltre il 99% di cellule umane, anche in assenza di selezione dei farmaci. Le cellule di nuova derivazione potrebbe essere iniettato nuovamente in topi immunodeficienti per testare le proprie capacità metastatica, come descritto sopra.
4. Rappresentante Risultati
- Alla fine di questo saggio, una linea di cellule altamente metastatico cancro al solito dà origine a metastasi polmonari molti (Figura 1), 1 mentre le metastasi polmonari pochissimi arriveranno da una linea del cancro metastatico delle cellule male.
- Le cellule derivate con questo metodo di solito danno luogo a metastasi più rispetto alla linea dei genitori, quando vengono testati di nuovo da questo test. 1-3
Figura 1. Immagini Rappresentante dei polmoni del mouse dopo iniezioni coda vena delle cellule tumorali. 5 x 10 5 della linea di cellulari di melanoma metastatico umano, le cellule SM, 4 sono stati iniettati nella vena caudale di topi immunodeficienti. Due mesi più tardi, i polmoni sono stati isolati e le metastasi sono stati trovati sparsi tra il tessuto polmonare normale.
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Discussion
Metastasi è la principale causa di morte nei pazienti oncologici. Si tratta di quattro fasi principali: il distacco delle cellule tumorali dal loro loci primaria, la loro entrata in circolazione (intravasation), la loro uscita dalla circolazione (stravaso), e la sopravvivenza e la crescita in un organo lontano. Metastasi in umano è considerato un processo lento e spesso si manifesta dopo anni di latenza. Per studiare la sua progressione in modo tempestivo, quanto sopra relativamente rapido test sperimentale è stato stabilito in topi immunodeficienti. 4 Dalla sua fondazione, è stato utilizzato in modo efficace per isolare le cellule con differenti capacità metastatica, identificare i geni che sono up-o down-regolato durante la metastasi 1,2,5, e testare il ruolo causale di questi geni durante la metastasi 3.
Il passo più impegnativo in questo saggio è quello di iniettare le cellule nella vena della coda. Ci vuole pratica per padroneggiare le abilità per via parenterale. Anche per un ricercatore esperto, diverse prove prima di ottenere una iniezione di successo sono molto comuni. Vene in frac mouse sono aghi estremamente sottili e inserire nel bel mezzo di loro non è facile. Il riscaldamento della coda brevemente con una lampada e massaggiando delicatamente la coda prima di iniezioni potrebbe indurre la dilatazione dei vasi sanguigni e facilitare le iniezioni. Un errore comune per la maggior parte dei ricercatori è di assumere che le vene sono profonde nella coda e quindi iniettare le cellule troppo in profondità nella pelle. Le vene sono in realtà molto vicino alla superficie della pelle, quindi si dovrebbe cercare di iniettare come superficialmente possibile.
Se l'ago è inserito con successo all'interno della vena, l'iniezione dovrebbe andare senza problemi con nessuna resistenza. Se l'ago non è inserito nella vena, ma nei tessuti adiacenti, campioni iniettato si accumula la pressione del fluido in fretta e poi impedire la consegna di tutto il resto dei campioni. Ognuna di queste prove non si perdono così una parte dei campioni. Per minimizzare questa perdita, un ricercatore cerca di prevedere se l'ago è in vena o non iniettando una quantità minima di campione e valutare la resistenza alla pressione del fluido. Se si sente la resistenza, l'ago non deve essere in vena e sarà quindi estrarre l'ago e riprovare. Se non si avverte resistenza, l'ago deve essere in vena e tutti i campioni verranno iniettati contemporaneamente. In quest'ultimo caso, si possono spesso vedere la "spara" campione la vena, spostando il sangue in quanto rende la sua strada verso il corpo.
Quando per terminare il test deve essere determinato empiricamente per ciascuna linea cellulare, dal momento che varia significativamente a seconda del potenziale metastatico delle cellule. I topi sarà sezionato in diversi momenti dopo le iniezioni e l'estensione di metastasi ai polmoni è determinata. Un periodo di tempo che si traduce in un numero numerabile di metastasi polmonari microscopicamente rilevabile è di solito scelto, dato che fornisce un risultato quantitativo e lascia spazio a ogni aumento o diminuzione di metastasi causate da perturbazioni dei geni candidati. Per i ricercatori che svolgono questo saggio per la prima volta, utilizzando una linea cellulare altamente metastatico (come la linea di cellule umane di melanoma, A375, o suoi derivati altamente metastatico) come controllo positivo è altamente raccomandato. Inoltre, età e sesso dei topi influenzare i risultati in maniera significativa, per cui si consiglia di mantenere le età e di genere coerenti quando la capacità metastatica delle diverse linee cellulari vengono confrontati. A causa delle variazioni introdotte dai fattori di cui sopra, almeno cinque topi deve essere iniettato per ciascuna linea cellulare di raggiungere alcuna conclusione statisticamente significativa.
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Acknowledgments
Questo protocollo è stato testato e ottimizzato inizialmente in laboratorio del Dr. Richard Hynes (MIT). Il finanziamento è fornito dalla PREMIO IDEA NYSTEM (a LX) e Ruth L. Kirschstein Premio Nazionale Research Service (a LX).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 10313-021 | |
| FBS | Hyclone | SH30088.03 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-095 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| KCl | Mallinckrodt Baker Inc. | 6838-04 | |
| Na2 HPO4.7H2O | Mallinckrodt Baker Inc. | 7896-04 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt Baker Inc. | 7100-12 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| EDTA-Na | EMD Millipore | 4010 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| Trypsin 2.5% | Invitrogen | 15090-046 | |
| Ethanol | Ultrapure | 200-CSGP | |
| 50 ml Falcon Tube | VWR international | 89039-656 | |
| Microcentrifuge Tubes | Axygen Scientific | MCT-175-C | |
| Falcon 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 5ml Falcon Culture Tube | VWR international | 60818-576 | |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 15170-208 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 329650 | |
| 30 ½ gauge needle | BD Biosciences | 305106 | |
| Mouse restrainer | Plas Labs Inc. | 551-BSRR | |
| Surgical scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-902 | |
| Dissecting Microscope | Nikon Instruments | SMZ1500 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 75003491 |
References
- Xu, L. Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases. Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).
- Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).
- Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).
- Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice. J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).
- Kang, Y. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).
